Charakterisierung des immunmodulatorischen Einflusses probiotischer und humanpathogener Hefen auf dendritische Zellen

Abstract

Einleitung: Für die Pathogenese chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (CED) wird insbesondere der Verlust von Toleranz gegenüber luminalen mikrobiellen Antigenen diskutiert. Eine zentrale Rolle in Entzündungsvorgängen nimmt die myeloide dendritische Zelle (mDC) ein. Die Interaktion von mDC und Hefen ist bei CED bisher wenig untersucht. Methoden: Aus Blut gesunder Probanden und Patienten mit CED wurden primäre CD1c+CD11c+CD14-CD19-mDC isoliert und mit Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert. Es wurde die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80, CD40 sowie des Migrationsmarkers CCR7, die Sekretion von TNF-α und IL-10 sowie die Proliferation naïver CD4+CD45RA+ T-Zellen (TC) in der allogenen gemischten Lymphozytenreaktion in Abhängigkeit von den verwendeten Hefemedien untersucht. Dafür wurden steril filtrierte Überstände der probiotischen Hefe Saccharomyces cerevisiae Hansen CBS 5926 (ScÜ) und die mittels Membranpartitionschromatographie hergestellten Filtrate verwendet. Das Filtrat Sc <3kDa wurde durch Elution in hydrophobe und hydrophile Fraktionen aufgetrennt und das erste Eluat mit einer β-Glukanase verdaut. Um die immunmodulatorischen Effekte probiotischer und humanpathogener Hefen zu vergleichen, wurden Überstände aus einer definierten Zellzahl von Sc, Saccharomyces boulardii (Sb) sowie Candida albicans ATCC 2091 (Ca) hergestellt. Mittels vergleichender Immunphänotypisierung wurde die Expression von CD80, CD40 und CCR7 sowie die Sekretion der Zytokine TNF-α und IL-10 gemessen. Die Struktur der immunmodulatorischen Komponenten der Hefemedien definierter Zellzahl wurde durch Monosaccharid- und Glykokonjugatanalyse näher charakterisiert. Ergebnisse: Ein antiinflammatorischer Effekt des Überstands und der Filtrate von Sc auf mDC gesunder Probanden und Patienten mit CED wurde nachgewiesen. Die Proliferation naïver TC wurde durch ScÜ inhibiert. Die Membranpartitionschromatographie erlaubte die Eingrenzung des Molekulargewichts der aktiven Komponenten auf < 3kDa. Die Elutionsreihe zeigte den positiven Effekt in den hydrophilen Eluaten. Der β-Glukanaseverdau hatte keinen Einfluss auf den Effekt. Immunphänotypisierungen zeigten unter Hinzufügen des Überstands von Sc, Sb und Ca einen reduzierten Anteil CD80-, CD40- sowie CCR7-positiver mDC. Auf der Ebene der Zytokine nahm die Sekretion von TNF-α ab und von IL-10 zu. Der antiinflammatorische Effekt wurde besonders effektiv durch die 1:8-Verdünnung entfaltet. Es wurden hydrophile Komponenten mit einem niedrigen Oligomerisierungsgrad als antientzündliche Komponenten vermutet. Eine Monosaccharidanalyse zeigte, dass Glukose und Mannose in den Überständen und Filtraten von Sc, Sb sowie Ca vorhanden waren. Mittels Glykokonjugatanalyse konnte das Vorhandensein von Oligosacchariden bestätigt werden. Schlussfolgerung: In der vorliegenden Arbeit wurden vergleichende Untersuchungen zur Immunmodulation probiotischer und humanpathogener Hefen auf CD1c+CD11c+CD14-CD19- mDC durchgeführt. Hydrophile Oligosaccharide mit einem Grundgerüst aus Glukose oder Mannose sowie einem Molekulargewicht <3kDa werden als antiinflammatorische Moleküle der Hefemedien von Sc, Sb und Ca angesehen.

Introduction: Loss of tolerance against luminal microbial antigens is thought to be a critical factor in pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Myeloid dendritic cells (mDC) play a pivotal role in inflammatory responses. Interaction of mDC and yeast in IBD is not well studied yet. Methods: Primary CD1c+CD11c+CD14-CD19- mDC from healthy controls and IBD patients were isolated and stimulated with lipopolysaccharide (LPS). Immunophenotyping was performed to quantify expression of the costimulatory molecules CD80, CD40 and the migration marker CCR7, secretion of TNF-α and IL-10 as well as proliferation of CD4+CD45RA+ naïve T cells (TC) in an allogenic mixed lymphocyte reaction. Therefore sterile filtrated Saccharomyces cerevisiae Hansen CBS 5926 supernatant (ScS) was fractionized into filtrates using membrane partition chromatography. By elution series, Sc <3 kDa was divided into hydrophobic and hydrophilic eluates and the latter were digested using a β-glucanase. In order to compare immunomodulatory activities of probiotic and pathogenic yeast, Sc, Saccharomyces boulardii (Sb) and Candida albicans ATCC (Ca) were cultured to a defined cell concentration and the supernatant was passed through a sterile filter. Comparative immunophenotyping was used to evaluate the number of CD80-, CD40-, CCR7-positive mDC and the secretion of TNF-α and IL-10. Using a monosaccharide and glycoconjugate analysis, the structure of the active components within the yeast media was characterized. Results: In brief, maturation of activated mDC from healthy controls and IBD patients was inhibited using ScS and its filtrates. Proliferation of naïve TC was inhibited using ScS. As evaluated by membrane partition chromatography, the molecular weight of the active components of Sc was <3kDa. The elution series indicated that hydrophilic components were responsible for the shown effect. Digestion with a β-glucanase did not affect the effect. Comparative immunophenotyping showed that supernatant of Sc, Sb and Ca reduced the number of CD80-, CD40- and CCR7-positive mDC. In addition, the secretion of TNF-α was attenuated and the secretion of IL-10 elevated. A serial dilution showed an optimal antiinflammatory effect using a 1:8 dilution. Thus, hydrophilic molecules with low oligomerisation might be the active components within the yeast media. As shown by monosaccharide analysis, glucose and mannose were represented within all media. A glycoconjugate analysis confirmed the presence of oligosaccharides. Conclusion: This work performed comparative investigations of immunomodulation by probiotic and pathogenic yeast on CD1c+CD11c+CD14-CD19- mDC. Hydrophilic oligosaccharides with a glucose or mannose backbone and a molecular weight of <3kDa were regarded as antiinflammatory components within the yeast media of Sc, Sb and Ca.