Correlating Structure and Function: An EPR Study on Cryptochromes, LOV Proteins and Channelrhodopsin

Abstract

The perception of light is essential to many organisms, as it is an important source of spatial and temporal information. Accordingly, there are many photosensitive proteins that regulate behavioural and physiological responses. It is because of this that the investigation of photoreceptor proteins has garnered continued scientific interest. One important aspect of a photosensor’s mechanism is the conformation of the signalling state. Electron paramagnetic resonance (EPR) has been established as a useful tool for probing the structure of a protein in solution. This work utilises EPR to investigate three different proteins, YF1, cryptochrome-2 and channelrhodopsin- 2\. YF1 is an example of a LOV protein, a diverse group of blue-light sensing pro- teins using a flavin chromophore. This work tries to elucidate the structure of the LOV domain’s signalling state as well as investigate the molecular basis for LOV proteins’ wide range of photocycle kinetics. Using EPR double resonance tech- niques, a structural model for the signalling state as well as a general motif for signal transduction is proposed. Photocycle kinetics are found to be influenced by amino acids in the chromophore’s environment in a manner that is predictable and consistent over different LOV domains. Cryptochromes are photosensing proteins closely related to photolyases. They, too, contain a flavin chromophore, and the photoreduction and following forma- tion of a flavin radical has long been held as the important first step in the form- ation of the signalling state. However, recent experiments on cryptochrome vari- ants that found them to be functional in vivo but lack photoreduction in vitro, have called this interpretation into question. This study addresses this issue, based on EPR’s ability to detect the flavin radical even in vivo. The apparent contradiction is resolved by the finding that small metabolites like ATP play an important part in enabling flavin photoreduction in vivo. Channelrhodopsins are light-gated ion channels from the rhodopsin protein fam- ily, that have recently come into the focus of research because of their potential for application in optogenetics. Information about the conformation of the open and closed states of channelrhodopsins is largely lacking. Using EPR-based distance measurements, this work investigates the closed- and open- state structure of ChR2. A movement of two helices is identified and found to be similar to changes reported for bacteriorhodopsin, despite ChR2’s different transmembrane structure.

Die Fähigkeit, Licht wahrzunehmen ist für viele Organismen von zentraler Bedeu- tung, da Licht als Quelle für Informationen über Zeit und Richtung dienen kann. Entsprechend gibt es diverse Proteine, die regulierend in Verhaltens- und physio- logische Prozesse eingreifen. Durch die große Bedeutung von Lichtrezeptoren ist ihre Erforschung von großem wissenschaftlichen Interesse. Ein wichtiger Aspekt des Signalmechanismus von Photorezeptoren ist die Struk- tur ihres Signalzustandes. Elektron- Paramagnetische Resonanzspektroskopie (EPR), hat sich als Methode etabliert, Konformationen von Proteinen in Lösung zu un- tersuchen. In dieser Arbeit wird EPR zur Untersuchung von drei verschiedenen Proteinen, YF1, Cryptochrome-2 und Kanalrhodopsin-2, verwendet. YF1 ist ein Beispiel für ein LOV-Protein, eine diversifizierte Gruppe von blau- lichtempfindlichen Proteinen, die ein Flavin als Chromophor verwenden. Mit Hilfe von EPR Doppelresonanzmethoden wird ein Strukturmodell für den Lichtzustand sowie ein Modell für die Signalweiterleitung vorgeschlagen. Aminosäuren in der Umgebung des Flavins werden identifiziert, die die Kinetik des Photozyklus kon- sistent und über verschiedene LOV-Domänen hinweg, beeinflussen. Cryptochrome sind mit Photolyasen eng verwandte Lichtrezeptoren. Wie LOV- Proteine enthalten sie ein Flavin als Chromophor. Die Photoreduktion mit anschlie- ßender Bildung eines Flavinradikals wurde gemeinhin als initialer Schritt der Aus- bildung des Signalzustandes angenommen. Jüngere Experiment an Cryptochrom- Varianten, die funktionsfähig in vivo waren, jedoch in vitro keine Photoreduktion zeigten, stellen diese Hypothese jedoch in Frage. Um diesen Widerspruch aufzuhe- ben, nutzt dieses Werk die Empfindlichkeit der EPR-Spektroskopie aus, die es ihr ermöglicht, das Flavinradikal auch in vivo nachzuweisen. es wird gezeigt, dass am Metabolismus beteiligte Moleküle wie ATP die Flavinreduktion stark fördern. Kanalrhodopsine sind lichtgesteuerte Ionenkanäle aus der Familie der Rhodop- sine, deren Erforschung durch klare Anwendungsmöglichkeiten in der Optogene- tik an großer Bedeutung gewonnen hat. Die Struktur des offenen Zustandes von Kanalrhodopsin ist noch weitgehend unbekannt. Mit Hilfe von EPR-basierten Ab- standsmessungen werden die Strukturen des offenen und geschlossenen Zustand in dieser Arbeit untersucht. Die Bewegung zweier Helizes beim Öffnen des Ka- nals kann gezeigt werden. Diese Bewegung entspricht den in Bakteriorhodopsin Nachgewiesenen, obwohl sich die Strukturen der beiden Proteine unterscheiden.