Synthese fluorierter 1,10-Phenanthrolin-Derivate und Erfassung der biologischen Aktivität ihrer Kupfer(II)-Komplexe

Abstract

Künstliche Nukleasen stellen ein interessantes Werkzeug für biochemische Anwendungen dar, wobei als Target der Träger der Erbinformationen in den Zellen, die Desoxyribonukleinsäure (DNA), dient. Mithilfe solcher Nukleasen können DNA-Moleküle gespalten werden, was u. a. in der Entwicklung von neuen Chemotherapeutika von Bedeutung ist. Sigman und Mitarbeiter entdeckten bereits Ende der 1970er Jahre die oxidative Spaltung von Nukleinsäuren durch Bis-(1,10-phenanthrolin)kupfer(I) {[Cu(phen)2]+}, der ersten Kupfer-basierten künstlichen Nuklease. Seitdem beschäftigten sich zahlreiche Arbeiten mit diesem System, um die Mechanismen der DNA-Spaltung aufzuklären und/oder die Nukleaseaktivität zu verbessern. Keine dieser Arbeiten beinhaltete jedoch den Einfluss von Fluorierungen des Liganden auf die Bioaktivität, trotz der verbreiteten Anwendung von Fluor- und Trifluormethylsubstituenten zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften von bioaktiven Molekülen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nun der Effekt der Einführung von fluorhaltigen Substituenten am phen-Gerüst auf die Nukleaseaktivität und die DNA- Bindungseigenschaften der jeweiligen Kupferkomplexe untersucht. Zunächst wurden verschiedene fluorhaltige phen-Derivate mithilfe einer modifizierten Skraup-Reaktion dargestellt. Es konnten fünf Liganden der Zusammensetzung 5-X-phen (X = F, CF3,OCF3, SCF3, SF5) und 5,6-Difluorphen synthetisiert werden, wobei vier der Derivate (X = CF3, SCF3, OCF3, SF5) zum ersten Mal dargestellt wurden. Die Liganden konnten mit Kupfer(II)nitrat zu Komplexen mit der Grundstruktur [Cu(Xphen)2]2+ (X = F, F2, CF3, SCF3, SF5) umgesetzt werden. Die Komplexe zeigten in Gegenwart von Ascorbinsäure als Reduktionsmittel eine hohe Nukleaseaktivität, wenngleich diese für die fluorhaltigen Komplexe geringer als für den unsubstituierten Komplex [Cu(phen)2]2+ ausfiel. Zusätzlich wurden DNA-Bindungsstudien mit den Kupfer(II)-Komplexen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die DNA-Affinität mit steigender Substituentengröße abnimmt. Die gleichzeitige Abnahme von DNA-Affinität und Nukleaseaktivität der Komplexe weist auf einen engen Zusammenhang zwischen diesen beiden Parametern hin. Die fluorhaltigen Kupfer(II)-Komplexe fungierten interessanterweise, im Gegensatz zu [Cu(phen)2]2+, als selbstaktivierende Nukleasen und zeigten DNA-Spaltaktivität in Abwesenheit von Reduktionsmittel. Dabei konnte ein Zusammenhang zwischen dem Redoxpotential der Kupferkomplexe und deren DNA-Spaltung aufgezeigt werden. So wies der Komplex [Cu(F2phen)2]2+ gleichzeitig die höchste Nukleaseaktivität und das positivste Redoxpotential der untersuchten Komplexe auf. Das zweite zu untersuchende System beschäftigte sich mit den Kupfer(II)-Komplexen von 2-Methyl-1,10-phenanthrolin (Mephen) und dessen Derivaten 5(6)-X-2-Mephen (X = fluorhaltiger Substituent). Die Synthese der Liganden mit unterschiedlichen Substituenten (F, CF3, SCF3, SF5) gelang mittels Doebner-von Miller-Reaktion, einer Modifikation der Skraup-Reaktion. Bis auf SF5Mephen konnten für alle Mephen-Derivate definierte Komplexe der Zusammensetzung [Cu(XMephen)2]2+ erhalten werden. Diese Kupfer(II)-Komplexe zeigten in Gegenwart von Ascorbinsäure jeweils eine hohe Nukleaseaktivität, wobei auch hier DNA-Affinität und DNA-Spaltaktivität miteinander korrelierten. Sowohl Nukleaseaktivität als auch DNA-Affinität nahmen mit steigender Substituentengröße (H < F < CF3 < SCF3) ab. Ohne Reduktionsmittel konnte hier hingegen keine Spaltung von Plasmid-DNA beobachtet werden. Während die Affinität der Komplexe des [Cu(XMephen)2]2+-Systems für DNA verglichen mit den analogen Komplexen des nicht-methylierten Systems [Cu(Xphen)2]2+ (X = H, F, CF3, SCF3) größer oder zumindest gleich groß ist, zeigen die Komplexe der nicht-methylierten Derivate eine höhere Nukleaseaktivität. Beide Komplexsysteme wiesen überdies eine hohe Zytotoxizität für MCF-7-Zellen (Brustkrebszelllinie, IC50 < 10 μM) auf, wobei der genaue Wirkmechanismus in der Zelle noch unklar ist und dessen Aufklärung weitere Untersuchungen erfordert. DNA-Spaltaktivität und Zytotoxizität der Komplexe korrelierten nicht direkt miteinander, ein Zusammenhang zwischen beiden Eigenschaften kann jedoch trotzdem nicht ausgeschlossen werden, da andere Aspekte bisher noch nicht betrachtet wurden (z. B. die Aufnahme und Verteilung der Komplexe in den Zellen).

Artificial nucleases are powerful tools for biochemical and medicinal applications. They target one of the most fundamental biomolecules, the DNA, which is carrying the genetic information. Its uniqueness in transferring genetic information makes it fundamental for cancer research, having in mind that modifications in DNA strands can be responsible for the conversion of healthy into cancer cells. Artificial nucleases can initiate apoptosis in cancer cells via cleaving the DNA of the cell. One of the first developed and well understood systems is bis(phenanthroline)copper(I), [Cu(phen)2]+, reported by Sigman and co-workers in the late 70's of the last century. In the last three decades there was a lot of research to improve and understand this system, but no one has looked into fluorination of the ligand system. This is surprising, since fluorination is a very often used tool for enhancing bioactivity of pharmaceuticals. Our focus was on studying the influence of fluorine-containing groups located on the phenyl moiety (5-Xphen), especially regarding the bioactivity of the copper-phen system including affinity towards DNA, cleavage activity and cytotoxicity against specific types of cancer cells. The first topic included the synthesis of phenanthroline derivatives with different fluorine-containing substituents. This was achieved with a modified Skraup reaction under milder conditions. We managed to generate five fluorine-containing derivatives of the form 5-Xphen (X = F, CF3, SCF3, OCF3, SF5) plus the difluorinated 5,6-diFphen, out of which four have not been synthesized before (X = CF3, OCF3, SCF3, SF5). We could obtain copper(II) complexes of the structure [Cu(Xphen)2]2+ for all ligands except OCF3phen. The copper(II) complexes are excellent DNA cleavers in the presence of ascorbic acid as reducing agent and show good binding abilities for DNA. Both cleaving and binding ability decreased with expanding substituent size (H < F < CF3 < SCF3 < SF5) so that we can conclude a strong relationship between binding ability and cleavage activity. Interestingly the fluorine-containing complexes showed self-activated nuclease activity without any reducing agent in contrast to the unsubstituted [Cu(phen)2]2+. Probably this activity exists due to the more positive redox potentials of fluorinated [Cu(Xphen)2]2+ complexes and an easier activation of the copper(II) complex via reduction. Quenching experiments suggest an oxidative cleavage mechanism. The reason for activation of copper(II) is still unclear, possible considerations are reduction through DNA components like bases (e. g. guanine). The second investigated system are copper(II) complexes of 2-methyl-1,10-phenanthroline (Mephen) and certain fluorine-containing derivatives. This system is interesting because no previous studies with [Cu(Mephen2]+/2+ have been reported before and it is a kind of structural intermediate of the inactive [Cu(2,9-dimethylphen)]+/2+ and the highly active [Cu(phen2]+/2+ system. Moreover, the methyl group makes it attractive due to possible functionalizations at this group. The complexes show high nuclease activity in the presence of ascorbic acid and high binding abilities for DNA. Just like in the [Cu(phen)2]2+ system binding ability and cleavage activity decrease with increasing substituent size. In contrast to the former system no hints for self-activated nuclease activity were found. Both systems, [Cu(Xphen)2]2+ and [Cu(XMephen)2]2+, were found to be highly cytotoxic to MCF-7-cells (breast cancer cells, IC50 ≤ 10 μM) with little higher toxicity for the methylated analogues. In contrast, nuclease activity of the non-methylated species is higher compared to the methylated ones. No clear correlation between nuclease activity and cytotoxicity was found and the mode of action for toxicity is still unclear. Nevertheless, a relation between nuclease activity and cytotoxicity cannot be excluded due to other aspects (e. g. uptake and distribution of the complexes in cells).