Zusammenfassung
Infizierte Zellen präsentieren dem Immunsystem auf ihrer Zelloberfläche antigene Peptide, die aus eingedrungenen Pathogenen generiert werden. Der Präsentation der Peptide geht die korrekte Assemblierung des MHC-Peptid- Komplexes im Endoplasmatischen Retikulum (ER) voraus. Innerhalb dieser Arbeit wird gezeigt, daß das ER-residente Protein Tapasin die Peptidbeladung auf MHC- Klasse-I-Moleküle sowohl in quantitativen als auch in qualitativen Aspekten positiv beeinflußt. Die Rekonstitution der Peptidbeladung in der B-lymphoblastoiden Zelllinie 721.220 durch die Expression von Tapasin führt auf der Plasmamembran der Zellen zu einer Steigerung der Menge an langlebigen MHC-Klasse-I-Molekülen, an die Peptide optimaler Länge binden.
Die Selektion stabiler MHC-Peptid-Komplexe geschieht durch Tapasin im ER, indem das MHC-Klasse-I-Molekül in einen TAP-assoziierten Beladungskomplex rekrutiert und dort die Peptidbeladung optimiert wird. Tapasin induziert zunächst die Bildung zweier Subkomplexe: zum einen wird Calretikulin an das MHC-Molekül rekrutiert, zum anderen wird die Thioreduktase ER60 Tapasin- vermittelt an TAP gebunden. Die Tapasin-vermittelte Brückenbildung zwischen diesen beiden Subkomplexen führt auf den untersuchten HLA-B*4402- und HLA-B8-Molekülen zur verbesserten Ausbildung allospezifischer Bw4-/Bw6-Epitope. Lösliche Tapasin-Konstrukte und Maus-Tapasin sind nicht in der Lage, den vollständigen Beladungskomplex aus dem MHC-Klasse-I-Molekül, Calretikulin, ER60 und TAP zu assemblieren. Die in diesen Fällen suboptimale Peptidbeladung ist durch eine kürzere Lebensdauer an der Zelloberfläche und eine geringere Thermostabilität der MHC-Moleküle im Lysat gekennzeichnet.
Mit den Ergebnissen dieser Arbeit kann Tapasin in funktionelle Domänen eingeteilt werden. Es wurde gezeigt, daß die N-terminale Domäne von Tapasin für die Peptidbeladung auf HLA-B8 und HLA-B*4402 Moleküle essentiell ist. Schon die Deletion von 19 Aminosäuren am N-Terminus von Tapasin verhindert die Plasmamembran-expression dieser MHC-Moleküle. Unverkürztes Humanes und murines Tapasin sind darüberhinaus in der Lage, die Expression von TAP über ihre Membranregion bis auf das 10fache zu steigern. Fehlt die Membran- und zytoplasmatische Domäne, ist keine Steigerung der TAP-Expression nachweisbar. Die Unterbrechung eines Leucin-Reißverschlußmotivs im Transmembranbereich von Tapasin durch den Aminosäureaustausch L410F hebt die ER-Retention von Tapasin teilweise auf und führt zu einem um 70-80% erniedrigten TAP-Expressionsniveau.
Summary
An infected cell is recognized by the immune system via pathogen-derived antigenic peptides. The surface presentation of these peptides is achieved by the assembly of a MHC class I-peptide complex in the endoplasmic reticulum (ER). In this PhD thesis tapasin is shown to positively influence peptide loading on MHC class I molecules in quantitative as well as in qualitative terms. Reconstituting the peptide loading defect in the B-lymphoblastoid cell line 721.220 by the expression of tapasin induces the plasma membrane expression of long-lived MHC class I molecules carrying an optimized spectrum of peptides.
Tapasin facilitates the selection of peptides in the ER by recruiting the MHC class I molecule into the TAP loading complex. The assembly of two subcomplexes is promoted by tapasin: on one hand calreticulin is recruited to the MHC molecule, and on the other hand the thioreductase ER60 is recruited to TAP through tapasin. On the HLA alleles investigated (HLA-B*4402 anh HLA-B8), the bridging of both subcomplexes by tapasin leads to enhanced binding of optimal length peptides and to the improved formation of Bw4/Bw6 epitopes. Soluble tapasin constructs and mouse tapasin are not able to assemble the complete loading complex consisting of the MHC molecule, calreticulin, ER60 and TAP. In these cases a suboptimal peptide loading is observed, characterized by a reduced half-time of class I molecules on the cell surface and a lower thermostability in lysates.
With the findings of this work, we can define functional domains of tapasin. It is shown, that the N-terminal domain of tapasin is essential for peptide loading onto HLA-B8 und HLA-B44 molecules. The deletion of only 19 amino acids at the N-terminus of tapasin abolishes surface expression of these alleles. The transmembrane region of tapasin interacts with TAP. In the presence of membrane-anchored human and murine tapasin the expression of TAP is enhanced by a factor of ten. By contrast, when the transmembrane region is missing, no enhancement of the steady-state levels of TAP were detectable. The importance of the membrane domain of tapasin has also become clear by the fact that a sole amino acid substitution (L410F) in the human protein sequence leads to 70-80% less TAP protein expression. This point mutation putatively destroys a leucin zipper motive which partially abolishes ER retention of tapasin.
