Expression and Regulation of the Neuronal Calcium Sensor Protein VILIP-1 and Effect on the α4β2 nAChR in Rat Hippocampal Neurons and Cell lines: Implications for Synaptic Plasticity

Abstract

Visinin-like protein-1 (VILIP-1) is a neuronal EF-hand Ca2+-binding protein. Here, I describe the distribution of the immunoreactivity detected by specific antibodies against VILIP-1 protein in rat peripheral tissue and in the brain at the light microscopic level. VILIP-1 antibodies stain neurons, but not glial cells, in the whole rat hippocampal formation, including principal cells in the CA1 and CA3 region of the Ammon's horn and in the dentate gyrus. Moreover, to analyze the precise distribution of VILIP-1 in hippocampal interneurons, immunofluorescence co-staining of VILIP-1 with the GABAergic neuronal marker, glutamic acid decarboxylase 67 (GAD67), and with different well defined neurochemical markers for perisomatic inhibitory cells (parvalbumin, PV), dendritic inhibitory cells (calbindin-D28k), and interneurons specialized to innervate other interneurons (calretinin, CR), were performed in rat hippocampal slices. Additionally, the co-localization of VILIP-1 with one of its interaction partners, the α4β2 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) has been studied. The α4β2 nAChR is the most abundant nAChR subtype with high-affinity for nicotine in the brain. The α4β2 nAChR is crucial for nociception, nicotine addiction and the beneficial effects of nicotine on cognition. VILIP-1, recently shown to affect clathrin- dependent receptor trafficking, interacts with the cytoplasmic loop of the α4 subunit. VILIP-1 enhances ACh responsiveness of hippocampal neurons, possibly comprising a novel form of physiological up-regulation of α4β2 nAChR. In the hippocampal formation VILIP-1 is co-localized with α4β2 nAChR in a distinct neuronal subpopulation consisting particularly of interneurons. Furthermore, enhancement of α4β2 nAChR induced by VILIP-1 leads to enhancement of inhibitory postsynaptic currents (IPSCs). Thus, VILIP-1 in conjunction with the α4β2 receptor might play an important role in modulating hippocampal network activity and synaptic plasticity. Interestingly in this context, induction of long term potentiation in the hippocampus correlates with increased expression levels of neuronal calcium sensor (NCS) proteins. We have investigated mGluR- and time-dependent changes in the expression of two different NCS proteins. Following DHPG application in vivo NCS-1 and VILIP-1 expression increased, with significant levels reached after 8 and 24h. Furthermore, the physiological effects of VILIP-1 upregulation were studied using patch-clamp recording from rat hippocampal neurons in vitro, indicating effects of VILIP-1 on neuronal excitability of hippocampal neurons.

In der vorliegenden Arbeit beschreibe ich auf lichtmikroskopischer Ebene die Immunreaktivität spezifischer Antikörper gegen Visinin-like protein-1 (VILIP-1), ein neuronales Kalzium (Ca2+)-bindendes Protein, in peripherem Gewebe sowie in Hirngewebe der Ratte. VILIP-1 Antikörper markieren Neurone in der ganzen Hippokampusformation, beispielsweise die Prinzipalzellen der CA1- und CA3-Region des Ammonshorns und Nervenzellen des Gyrus Dentatus, jedoch keine Gliazellen. Desweiteren wurden in hippokampalen Schnitten der Ratte Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen durchgeführt, um das Vorkommen von VILIP-1 in Interneuronen des Hippocampus genau zu analysieren. Dazu wurden der GABAerge neuronale Marker GAD67 (glutamic acid decarboxylase 67) und verschiedene gut charakterisierte neurochemische Marker für perisomatische inhibitorische Zellen (Parvalbumin, PV), für dendritische inhibitorische Zellen (Calbindin- D28k) und für Interneurone, die spezifische andere Interneurone innervieren (Calretinin, CR) eingesetzt. Weiterhin wurde die Kolokalisation von VILIP-1 mit einem seiner Interaktionspartner, dem α4β2 nikotinischen Azetylcholinrezeptor (nAChR), untersucht. Der α4β2 nAChR ist der häufigste Subtyp dieses Rezeptors im Gehirn mit einer hohen Affinität für Nikotin. Dieser Subtyp spielt eine wichtige Rolle bei der Nocizeption, bei der Nikotin- Abhängigkeit aber auch den positiven Effekten von Nikotin auf Kognition. VILIP-1, für das kürzlich gezeigt wurde, dass es den Clathrin-abhängige Rezeptortransport beeinflusst, interagiert mit der zytoplasmatischen Schleife der α4-Untereinheit des Rezeptors. Das Kalziumsensorprotein verstärkt das Reaktionsvermögen hippokampaler Neurone auf ACh wahrscheinlich über einen neuen Weg der funktionellen Hochregulierung des α4β2 nAChR. In der Hippokampusformation ist VILIP-1 mit dem α4β2 nAChR in einer neuronalen Subpopulation kolokalisiert, die insbesondere aus Interneuronen besteht. Die Verstärkung der Rezeptorantworten, die durch VILIP-1 ausgelöst wird, führt zu einer Verstärkung inhibitorischer postsynaptischer Ströme (IPSCs). Daher ist VILIP-1 in Verbindung mit dem α4β2 nAChR ein möglicher Modulator hippokampaler Netzwerkaktivität und synaptischer Plastizität. In diesem Zusammenhang ist interessant, dass die Induktion von Langzeitpotenzierung im Hippokampus mit einer erhöhten Expression von Kalciumsensorproteinen (NCS) korreliert. Wir haben mGluR- und zeitabhängige Veränderungen in der Expressionsstärke von zwei verschiedenen NCS-Proteinen untersucht. Als Resultat der Applikation von DHPG in vivo erhöhte sich die Expression von NCS-1 und VILIP-1 nach 8 und nach 24 Stunden signifikant. Zusätzlich wurden zur Analyse des physiologischen Effektes der erhöhten VILIP-1 Expression elektrophysiologische Messungen ( Patch-Clamp -Ganzzellableitungen) an hippokampalen Neuronen der Ratte in vitro durchgeführt, deren Ergebnisse auf einen Einfluss von VILIP-1 auf die neuronale Erregbarkeit hippokampaler Neurone hindeuten.