Einfluss lokal transplantierter mesenchymaler Stammzellen auf die Regeneration nach Skelettmuskeltrauma: Morphologie und Histomorphometrie

Abstract

Bis heute gelten schwerwiegende Weichteilverletzungen in der Traumatologie als nur unzureichend therapierbar. Durch Operationen oder Unfälle verursachte Funktionsdefizite der Muskulatur lassen sich in den meisten Fällen nicht wieder gänzlich herstellen. Das gewünschte Niveau des Zustandes einer Wiederherstellung der gesunden Ausgangssituation, im Sinne einer restitutio ad integrum, wird weder durch das aktuell vorherrschende Therapieregime, noch durch experimentelle Ansätze wie zum Beispiel den Einsatz von Wachstumsfaktoren erreicht. Um die Ausgangssituation eines schweren muskulären Quetschtraumas zu verstehen, bedarf es eines gut verstandenen Tiermodells zur Analyse der Regenerationsvorgänge. Hierfür analysierten wir ein standardisiertes Quetschtrauma im Rattenmodell in Bezug auf die Regenerationsvorgänge im achtwöchigen posttraumatischen Verlauf aus histologischer Sicht. Dabei lag der Schwerpunkt der histologischen Analyse neben der eigentlichen Charakterisierung des Traumaverlaufes in der Betrachtung der Fibrosebildung und der Angiogenese. Es wurde bereits mehrfach bewiesen, dass die lokale Transplantation von mesenchymalen Stammzellen (MSC) die muskuläre Regeneration, insbesondere bezogen auf die Kontraktionskraft, fördert. Wir entwickelten eine Methode die transplantierten mesenchymalen Stammzellen sowohl makro- als auch mikroskopisch zu verfolgen. Um die Ursachen der verbesserten muskulären Kontraktionskraft nach Stammzelltransplantation zu verstehen, analysierten wir die Fibrosebildung und die Angiogenese nach Transplantation. Methoden Für die histologische Analyse des posttraumatischen Zeitverlaufes wurde der Musculus soleus von Sprague-Dawley-Ratten in standardisierter Weise gequetscht. Danach wurde am 1., 2. und 4. posttraumatischen Tag sowie eine, vier und acht Wochen nach dem Trauma der Muskel histologisch untersucht. Um den allgemeinen posttraumatischen Verlauf zu analysieren wurde die Hämatoxylin & Eosin Färbung angewandt, für die Analyse der Fibrose wurde die Siriusrot Färbung und zur Auswertung der Angiogenese wurde ein immunhistochemische Färbeverfahren für α-smooth muscle actin (α-SMA) verwandt. Um die, vor der Transplantation mit very small ironoxid particles (VSOP) markierten, mesenchymalen Stammzellen zu visualisieren, wurde die Berliner Blau Färbung eingesetzt. Die Berliner Blau/Preussisch Blau Färbung ist dabei selektiv für Eisen und färbt somit die VSOP selektiv an. Um den Einfluss der MSC auf die posttraumatische Fibrosebildung und die Angiogenese zu untersuchen, erfolgte eine Woche nach dem Trauma die Analyse der Präparate im Vergleich mit der Kontrollgruppe mittels der Siriusrot Färbung und der Immunhistochemie für α-SMA. Hierbei wurde den Tieren der Kontrollgruppe Kochsalzlösung (NaCl) lokal injiziert. Ergebnisse Eine Woche nach dem Trauma fanden sich 40% lockeres Bindegewebe im traumatisierten Muskelgewebe. Nach vier Wochen reduzierte sich der Gehalt an Bindegewebe auf 25% und stagnierte an diesem Punkt bis zum letzten Messzeitpunkt, acht Wochen nach dem Trauma. Die Gefäßdichte zeigte in der ersten posttraumatischen Woche einen Anstieg, im weiteren Verlauf jedoch einen langsamen Abfall, als Zeichen einer langen Remodellingphase. Die Lokalisation der mittels VSOP markierten MSC durch die Berliner Blau Färbung korrelierte mit den makroskopischen Ergebnissen der MRT. Einzelne Fusionsereignisse zwischen regenerierenden Muskelfasern und MSC konnten mittels der Berliner Blau Färbung beobachtet werden. Die lokale Transplantation von MSC zeigte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Fibrosebildung oder die Angiogenese. Interpretation Die posttraumatische Regeneration der Skelettmuskulatur folgt einem klaren histologischen Zeitablauf. Das Ausmaß der posttraumatischen Fibrose spielt eine wesentliche Rolle in der Regeneration und kann nicht durch die lokale Transplantation von mesenchymalen Stammzellen beeinflusst/reduziert werden. Die Angiogenese weist eine lange Remodellingphase auf. Eine Beeinflussung durch die transplantierten MSC findet nicht statt. Die vereinzelt beobachteten Fusionsereignisse repräsentieren einen Teil des positiven Effektes der transplantierten mesenchymalen Stammzellen auf die Regeneration, können aber auf Grund ihrer Seltenheit nicht die Hauptursache sein. Um die Mechanismen der verbesserten Regeneration nach Stammzelltransplantation zu verstehen, bedarf es weiterer Studien. Ein Augenmerk sollte hierbei unter anderem der molekularen Ebene gelten, um unter anderem den parakrinen Effekten der Zellen nachzugehen.

To investigate the situation after a severe muscle trauma a well understood animal model is needed. To better understand the regenerative processes after a trauma, we completely analysed the timecourse of the posttraumatic situation histologically for the time of eight weeks. Two special targets were the amount of fibrosis and the angiogenesis. It is allready proven that the local transplantation of mesenchymal stem cells (MSC) improves muscle regeneration, especially the contraction force. A method of tracking the transplanted mesenchymal stem cells histologically was established and a correlation with the macroscopic findings with MRI was performed. To understand the reason of improved force after local stem cell transplantation a histological analysis in reference to fibrosis and angiogenesis after transplantation was made. Methods For the histological analysis of the time course of sceletal muscle injury soleus muscles of Sprague-Dawley rats were traumatised in a standardized manner. Muscles were analysed at day 1, 2 and 4 and week 1, 4 and 8 after trauma. Haematoxylin & Eosin (H & E) staining was used for a descriptive analysis, sirius-red staining was used for the analysis of fibrosis and an immunohistological stain against α-SMA was used for the evaluation of vessel density. For the visualisation of the transplanted VSOP- labeled MSC we used prussian-blue-staining. For the visualisation of MSC, the cells were labeled with VSOP before transplantation. For the ex vivo detection of the cells the prussian-blue-stain was used, which is selective for iron. The amount of collagenous connective tissue and the vessel density were evaluated for animals transplanted with MSC one week after trauma and control animals. Results One week after trauma loose connective tissue occupied 40 % of the traumatised muscle. The connective tissue decreased to about 25 % in the fourth week, stagnating at this point up to the eighth week. Vessel density showed an increase of the angiogenesis in the first week, slowly decreasing in the following weeks as a sign of a long remodelling phase. The localisation of VSOP-labeled MSC via prussian-blue correlated with the macroscopic findings in the MRI. Sporadic events of fusion between regenerating muscle fibers and mesenchymal stem cells could be observed. The local transplantation of mesenchymal stem cells did not have a significant influence on the amount of fibrotic tissue or angiogenesis. Interpretation The posttraumatic regeneration of skeletal muscle follows a clear histologic timecourse. The substancial amount of fibrosis plays a main role in the regeneration and is not influenced/ reduced by the local transplantation of mesenchymal stem cells. The observed fusion events may represent a part of the mechanism of action of MSC-therapy in