Kristallstrukturen von ortsgerichtet mutierten Kälteschockproteinen aus Bacillus caldolyticus wurden gelöst, um die strukturellen Determinanten der Thermostabilität auf atomarer Ebene zu klären. Die fünf Mutanten stellen den Übergang vom thermophilen Protein zu seinem mesophilen Homologen dar. In ihnen sind Aminosäuren an den Positionen variiert, die für den Unterschied in der Thermostabilität verantwortlich sind. Dabei galt das Augenmerk besonders den beiden Resten Arg3 und Leu66. Beide Residuen tragen im wesentlichen für den Unterschied von 15,8 kJ·mol-1 bei der Freien Energie der Entfaltung bei. Die restlichen zehn Unterschiede haben nur ganz geringen Einfluß auf die Stabilität. Beide Proteine haben die prinzipiell gleiche Struktur und unterscheiden sich nur in Details. Die kleinen und kompakten Proteine enthalten keine Cysteine, cis-Proline und keine fest gebundene Cofaktoren. Wie aus den Strukturen von Bc-Csp und Bs-CspB bekannt ist, liegen die beiden Reste Arg3 und Leu66 in der Struktur dicht beieinander. Daher wurden auch potentiell wechselwirkende benachbarte Reste in Strukturanalysen einbezogen. Die Kristallstrukturen von beiden Mutanten, Bc-Csp R3E und Bc-Csp L66E konnten mit nahezu atomarer Auflösung bestimmt (1,4 Å und 1,27Å) und zu R-Werten R/Rfree von 13,9%/20,2% und 15,8%/18,9% verfeinert werden. Beide Strukturen haben die gleiche globale Faltung, zeigen aber zwischen den beiden Molekülen in der asymmetrischen Einheit unterschiedliche Wasserstoff- und Salzbrückenmuster. Mit der Einbeziehung des benachbarten Glu46 sowie durch die Tripelmutanten Bc- Csp R3E/E46A/L66E und Bc-Csp V64T/L66E/67A konnte die Verteilung der Oberflächenladung um die Positionen 3 und 66 untersucht werden. Die Mutanten Bc-Csp E46A, Bc-Csp R3E/E46A/L66E und Bc-Csp V64T/L66E/67A wurden kristallisiert, ihre Struktur bis 1,8 Å, 1,32 Å bzw. 1,8 Å gelöst und zu R-Werten R/Rfree von 18,5%/23,4%, 13,9%/18,1% und 19,3%/24,6% verfeinert. Eine systematische Analyse aller Mutanten zeigt, daß alle Strukturen sich sehr ähnlich sind aber in jeder Mutante unterschiedliche Muster an Wasserstoffbrücken und elektrostatischen sowie hydrophoben Wechselwirkungen an den Positionen 3 und 66 sowie seiner Nachbarn gefunden werden. Die Destabilisierung der Proteinmutanten scheint mit dem Auftreten eines ausgeprägten sauren Bereiches auf der Proteinoberfläche um die mutierten Reste korreliert zu sein. Aus dem thermodynamischen Analysen lassen sich keine attraktiven elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den mutierten Resten ableiten. Dies läßt sich anhand der Kristallstrukturen gut nachvollziehen. Es läßt sich vielmehr schlußfolgern, daß die Kälteschockproteine durch die Entfernung von repulsiven elektrostatischen Wechselwirkungen stabilisiert werden. KorB ist ein Repressorprotein aus E. coli und kontrolliert die Expression von RP4-Genen. Hierzu bindet es an eine pseudosymmetrische 13 bp lange Operatorsequenz (OB) die zwölfmal im 60 kb Plasmid präsent ist. Die Bindung des dimeren KorB an DNA wird von anderen Proteinen beeinflußt. Durch in situ Proteolyse im Kritsallisationsrtropfen ist das C-terminales Fragment von KorB (Reste 296 - 356) freigesetzt worden und das Fragment kristallisierte in dem selbigen. Analysen der Domänenstruktur und DNA-Bindungsstudien von KorB und KorB-N zeigen, daß das Nterminale Fragment die DNA-Bindungsstelle enthält. Durch limitierte Proteolyse konnte ein Domäne aus dem N-terminalen Fragment identifiziert werden, die die DNA bindende Region enthält. Das Fragment liegt in der zentralen Region von KorB Ein solches Fragment konnte in Gegenwart von einem 17 bp lanegn DNA-Fragment, daß die Operatorsequenz enthält, kristallisiert und gezeigt werden, daß die Kristalle Protein und DNA enthalten. Röntgenbeugungsdaten bis zu einer maximalen Auflösung von 1,7 Å konnten gesammelt werden. Die Kristallstruktur von KorB-C, der C-terminalen Domäne des Repressorproteins KorB, konnte in zwei Kristallformen mit einer maximalen Auflösung von 1,7 Å gelöst werden. Die Cterminale Domäne enthält die Reste 297 bis 356. KorB-C faltet in ein fünfsträngiges antiparalleles ?-Faltblatt. Die Stränge 1 bis 4 bilden ein up and down Faltblatt. Der fünfte Strang schließt das Faltblatt auf der offenen Seite von ?1. Zwischen ?4 und ?5 wird eine kurze 310- Helix beobachtet. Ein Strukturvergleich zeigte überraschenderweise, daß diese Faltung der ?Src homology 3 domain? (SH3-Domäne) ähnlich ist. SH3-Domänen sind aus eukaryotischen Signaltransduktionswegen bekannt und binden an prolinreiche Motive. Von der Anordnung der Moleküle in der Kristallstruktur wurde gefolgert, daß zwei Moleküle ein funktionell relevantes Dimeres bilden. Eine detaillierte Analyse der Kontaktfläche und begleitende Quervernetzungs-Studien deuten darauf hin, daß KorB-C eine Dimerisierungsdomäne bildet. Die Kontaktfläche wird von hydrophoben Resten dominiert und ist groß genug, die dimere Form des intakten KorB in Lösung zu stabilisieren. Somit wird eine Bindung an die palindromische Operatorsequenz unterstützt. Die Kristallstruktur von KorB-C ist ein weiteres Beispiel für eine SH3-ähnliche Struktur prokaryotischen Ursprungs. Die hier beobachtete Protein-Protein-Wechselwirkung erweitert den Rahmen an Bindungsmotiven für SH3- und SH3-ähnliche Domänen. Die SH3-SH3 Domänen- Wechselwirkung ist klar mit einer biologischen Funktion verbunden und ist in dieser Form und Anordnung das erstmal so beschrieben worden.
Crystal structures of site directed mutated cold shock proteins from Bacillus caldolyticus were solved to elucidate the structural reason for differences in the thermostabillity on atomic level. Five mutants represent the transition from the thermophile protein to the mesophile homolog. Here, the rest are mutated whose responsible for the differences in the thermostabillity. The both rest Arg3 and Leu66 have a exceptional interest. Both residues contribute to the difference in the free energy of unfolding of 15.8 kJ·mol-1 essentially. The other ten residues have no remarkable influence on the thermostabillity. Both proteins have the same structure in principle and differ in detail only. The small and compact proteins contain no cysteins, cis-prolines and strong bonded cofactors. From the structures of Bc-Csp and Bs-CspB is known, that the rest Arg3 and Leu66 are neighboring in the structure very closely. The structure analysis are enclosed neighboring residues, which can interact with Arg3 and Leu66. The crystal structure of the mutants Bc-Csp R3E and Bc-Csp L66E were solved with nearly atomic resolution (1.4 Å and 1.27Å) and refined to R-values of R/Rfree 13.9%/20.2% and 15.8%/18,9%. Both structure have the same global fold. Remarkable is, that they show varying patterns of hydrogen bonds and salt bridges between the both molecules in the asymmetric unit. Under consideration of the adjacent Glu46 and triple mutants Bc-Csp R3E/E46A/L66E and Bc-Csp V64T/L66E/67A could be examined the distribution on surface charges around positions 3 and 66.The mutants Bc-Csp E46A, Bc-Csp R3E/E46A/L66E and Bc-Csp V64T/L66E/67A were crystallized, the structure were solved up to a resolution of1.8 Å, 1.32 Å respectively 1.8 Å and refined to R-values of R/Rfree 18.5%/23.4%, 13.9%/18.1% and 19.3%/24.6%. A systematic analysis of all mutants shows very similar structures of all mutants. But in every structure are found different patterns of hydrogen bonds, electrostatic and hydrophobic interactions around position 3 and 66 and adjacent residues. It seems, that the thermal destabilization appears to correlate with extent of an acidic patch near the C-terminal carboxylate group on the surface of the cold shock mutants. But from the thermodynamic studies is no hint known for an existence of attractive electrostatic interaction between the mutated residues. That is not in contrast to the crystal structure. It could be concluded, that the cold shock proteins are stabilized by removing of repulsive electrostatic interactions. KorB is a repressor protein from E. coli and regulate the expression of RP4 genes. For that, KorB binds to a pseudo symmetric 13 bp operator (OB) sequence. The 60kb plasmid contain twelve copies of this OB. The binding of dimeric KorB to DNA is influenced by other proteins encoded by RP4. A C-terminal fragment (residues 297 to 356) was obtained after an in situ proteolysis in a crystallization droplet. Surprisingly, the C-terminal fragment crystallized in the same droplet. Further domain analysis and DNA binding studies of KorB revealed, that the N-terminal fragment contain the DNA bindings side. With limited proteolysis, with and without DNA, KorB-N could be restrict to a shorter fragment, that contain the DNA binding region. The fragment is localized in the central region of KorB. Such a fragment could be crystallized in the presence of 17 bp DNA fragment, containing the OB sequence. It was shown, that the crystals contain DNA and protein. This crystals diffract to a maximum of 1.7Å resolution. The crystal structure of C-terminal domain of the repressor protein KorB ,KorB-C, were solved in two different space group with a maximum resolution of 1.7Å. The C-terminal domain contains the rests 297 to 356. KorB-C is folded into a five stranded antiparallel ? sheet. The strands 1 to 4 form a up and down sheet. Strand 5 closed the sheet on the open side from strand 1\. Strand 4 and 5 are connected by a short 310-Helix. Quite unexpectedly a structure comparison shows a fold similar to the Src homology 3 domain (SH3-domain) for KorB-C. SH3 domains are well known from the eukaryotic signal transduktion pathway and bind to proline rich sequences. From the arrangement of the molecules in the structures was concluded, it is concluded that two molecules form a functional relevant dimer. The detailed examination of the dimer interface and chemical cross-link studies suggest that KorB-C forms a dimerisation domain. The dimer interface is dominated by hydrophobic residues and the size is big enough to stabilize the dimeric form of intact KorB. In this way, KorB-C stabilized the dimeric form of KorB in solution to facilitate binding to the palindromic operator sequence.. The crystal structure of KorB-C is a further example for a structure with a SH3 similar fold with prokaryotic origin. The observed structure extend the range of protein-protein interactions known to be promoted by SH3 and SH3-like domains. The SH3-SH3 interaction is connected with a biologic function clearly. This form and arrangement of interaction is described the first time for SH3-like domain
