Bedeutung von Galpha-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine und intrazellulärer Signalwege für die Regulation des vesikulären Monoamintransporters 1

Abstract

Die Kommunikation von Zellen in einem Organismus erfolgt unter anderem durch die Ausschüttung von Botenstoffen. Neurone und endokrine Zellen besitzen zu diesem Zweck spezielle Speicherorganellen für diese Botenstoffe, so genannte Vesikel. Durch Exozytoseprozesse können die Transmitter beispielsweise in den synaptischen Spalt oder ins Blut abgegeben werden. Neben zahlreichen Faktoren, die die Konzentration des jeweiligen Botenstoffes beeinflussen, kann auch der Füllungsgrad der Vesikel reguliert werden. In monoaminergen Systemen werden die Monoamine durch die vesikulären Monoamintransporter 1 und 2 (VMAT1 und 2) ins Vesikelinnere transportiert. Aus Vorarbeiten ist bekannt, dass die Monoaminspeicherung dieser Vesikel durch die G-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine reguliert wird. Kommt es zur Aktivierung der Go2-Untereinheit, wird die vesikuläre Monoaminspeicherung in Neuronen und neuroendokrinen Zellen gehemmt. In Thrombozyten konnte dieser Effekt ebenfalls gezeigt werden, allerdings ist dort die Gq-Untereinheit dafür verantwortlich. Als auslösendes Signal ist dabei der vesikuläre Füllungszustand anzusehen, wobei vermutlich die große intraluminale Schleife zwischen erster und zweiter Transmembrandomäne der VMAT als Sensor für die Füllung der Vesikel fungiert. Über die Signaltransduktionsprozesse, welche letztendlich zur Hemmung des vesikulären Monoamintransportes und auch zur Aktivierung des heterotrimeren G-Proteins führen, ist bisher wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Regulation des VMAT1 näher untersucht. Dabei wurden Hinweise auf Signaltransduktionsschritte, die der G-Protein Aktivierung nachgeschaltet sind, gefunden: Die sekundären Botenstoffe cAMP und cGMP, die bekanntermaßen in verschiedenen intrazellulären Signaltransduktionsprozessen eine Rolle spielen, bewirken eine Hemmung des vesikulären Monoamintransportes in PC12-Zellen. Es zeigte sich außerdem eine Verminderung der maximalen Transportgeschwindigkeit des VMAT1. Im Vergleich zu Voruntersuchungen mit den sekundären Botenstoffen cAMP und cGMP an Vesikelpräparationen des Mäusegehirns konnte kein signifikanter Unterschied im Ausmaß der Hemmung zwischen cAMP und cGMP gefunden werden. Weiterhin wurde die unterschiedliche Rolle verschiedener G-Untereinheiten in der G-Protein vermittelten Regulation der VMAT untersucht: In mit VMAT1-transfizierten CHO-Zellen konnte gezeigt werden, dass es zu einer Hemmung der vesikulären Serotoninaufnahme nach Transfektion dieser Zellen mit konstitutiv aktivem Go2 kommt. Eine Transfektion mit konstitutiv aktivem Go1 zeigte keine Beeinflussung der Monoaminaufnahme in die Vesikel. Hingegen kam es nach Transfektion mit konstitutiv aktivem Gq zu einer verstärkten vesikulären Serotoninaufnahme. Insgesamt konnten durch die Ergebnisse dieser Arbeit neue Erkenntnisse über die Regulation des VMAT1 gewonnen werden. Daran zeigt sich, dass die Regulation von VMAT1 und VMAT2 trotz gemeinsamer Elemente auch Unterschiede aufweist: Neben der Untermauerung der Bedeutung der Go2-Untereinheit konnte die differentielle Wirkung verschiedener -Untereinheiten je nach Gewebe oder exprimierter VMAT-Isoform gezeigt werden. Auch für die Beteiligung intrazellulärer sekundärer Botenstoffe an der VMAT-Regulation ergaben sich Hinweise auf Unterschiede zwischen den Signalwegen für VMAT1 und VMAT2.

The communication of cells in an organism occurs amongst others by the release of transmitters. For this purpose neurons and endocrine cells possess special storage organelles for these transmitters, so-called vesicles. By exocytosis, the transmitter is released, for example, into the synaptic gap or into the blood. Among many factors that are influencing the concentration of the transmitter, the filling degree of the vesicles can be controlled. In monoaminergic systems the monoamines are transported into the vesicle by the vesicular monoamine transporters 1 and 2 (VMAT1 and 2). Previous studies showed that the monoamine storage of these vesicles is regulated by the G subunits of heterotrimeric G-proteins. The activation of Go2 causes inhibition of vesicular monoamine storage in neurons and neuroendocrine cells. In platelets the Gq subunit is responsible for this effect. The vesicular filling state is considered to be the triggering signal of G-protein activation, and is presumably sensed by the large intraluminal loop between the first and second transmembrane domain of the VMAT. Little is known about downstream and upstream signal transduction cascades, which ultimately lead to the inhibition of the vesicular monoamine transport and to the activation of the heterotrimeric G-protein, respectively. In this work, the regulation of VMAT1 was investigated. The following information of downstream signalling pathways after G-protein activation could be gathered: The second messengers cAMP and cGMP, which are known to play a role in various intracellular signal transduction processes, cause an inhibition of the vesicular monoamine uptake into PC12 cells. A reduction in the maximum transport rate of VMAT1 could be shown. In contrast to previous investigations in vesicle preparations of the mouse brain, no significant difference in the degree of inhibition between cAMP and cGMP could be found. A second main focus was the investigation of the different role of various G subunits in the G-protein mediated regulation of VMAT: In VMAT1 transfected CHO cells an inhibition of the vesicular serotonin uptake could be demonstrated after transfection with constitutively active Go2. A transfection with constitutively active Go1 had no effect on monoamine uptake into the vesicles. In contrast transfection with constitutively active Gq results in an increased serotonin vesicular monoamine uptake. Taken together the results of this work yielded new insights into the regulation of VMAT1. Despite of common elements there are differences in the regulation of VMAT1 and VMAT2. In addition to the substantiation of the importance of Go2, the differential effect of various -subunits depending on the tissue or expressed VMAT isoform could be shown. There was also evidence for differences between the participation of intracellular second messengers in signaling pathways for VMAT1 and VMAT2.