Optimierung der Methoden zur Isolierung und Kryokonservierung von Primären Humanen Hepatozyten aus Leberteilresektaten

Abstract

Hintergrund: Primäre humane Hepatozyten (PHH) bilden einen wesentlichen Bestandteil aktueller Metabolisierungsstudien im Rahmen der Medikamentenforschung und sind unverzichtbar für die Entwicklung Zell- basierter klinischer Therapien. Aufgrund der eingeschränkten Anzahl geeigneter Zellquellen ist die Verfügbarkeit humaner Leberzellen stark limitiert, zusätzlich steigt die Nachfrage an Zellen kontinuierlich an. Um eine ausreichende Versorgung mit PHH gewährleisten zu können, müssen die vorhandenen Ressourcen für die Zellisolierung optimal ausgeschöpft sowie die verfügbaren Zellen effektiv eingesetzt werden. Ziel dieser Studie ist es daher, durch die Optimierung der Zellisolierung aus Leberteilresektaten sowie der Kryokonservierung von humanen Hepatozyten, diesem Versorgungsengpass entgegenzuwirken. Methoden: Humane Hepatozyten wurden unter Anwendung eines standardisierten 2-Schritt-Kollagenase-Perfusions-Protokolls aus Leberteilresektaten isoliert. Die Ausbeute vitaler Leberzellen wurde anschließend mit klinischen Charakteristika der Gewebespender (n = 50) korreliert, um so prognostische Faktoren für die Gewebespende zu definieren. Bei einem Teil der Spender (n = 15) wurde analog auch die Kultivierbarkeit und Funktion der frisch isolierten Hepatozyten untersucht. Das Verfahren der Kryokonservierung von PHH wurde durch den Zusatz des Disaccharids Trehalose als weiteres Kryoprotektivum optimiert. Hierzu wurden Hepatozyten verschiedener Spender (n = 9) unter Verwendung eines kontinuierlichen, computer-kontrollierten Protokolls eingefroren und nach dem Auftauen hinsichtlich Zellvitalität und Zellfunktion mit einer Kontrollgruppe verglichen. Ergebnisse: Die Erkrankung des Spenders hat einen signifikanten Einfluss auf das Ergebnis der Leberzellisolierung: Gewebe von Patienten mit gutartigen Lebererkrankungen ergab die höchste Zellausbeute, gefolgt von Gewebe, das aufgrund von sekundären und primären malignen Tumoren reseziert wurde. Relevanter Prognosefaktor für die Funktion der PHH ist eine pathologische Erhöhung der Gamma-Glutamyltransferase (γ-GT) im Spenderserum auf über 60 U/l: die Vitalität, das Gesamtprotein und die Albumin-Synthese dieser Zellen waren signifikant erniedrigt. Trehalose zeigt eine zytoprotektive Wirkung bei der Kryokonservierung von PHH. Eine Konzentration von 0,2M im Kryo-Medium ergab eine signifikante Erhöhung der Zellvitalität, der Adhärenzfähigkeit, des Gesamtproteins sowie der Albumin-Synthese. Zudem waren die Marker der Zellschädigung signifikant reduziert.

Primary human hepatocytes represent a valuable tool used in basic research and pharmacotoxicology. Hepatocytes of high quality and quantity are required, but supply is limited by the small number of adequate cell sources. In order to optimize cell availability, the present study investigates the influence of donor liver characteristics on the outcome of hepatocyte isolation from surgically removed liver tissue. Furthermore, the benefit of the disaccharide trehalose on the cryopreservation of primary human hepatocytes is examined. Applying standardized tissue procurement, hepatocytes were isolated from small liver samples (10-51g) using a standardized 2-step-collagenase perfusion technique. No significant influence was observed for the tissue donor´s sex, pre-operative blood parameters, previous chemotherapy or histopathology. Donor age significantly influences the isolation outcome, but as a single parameter, was not found suitable for predicting cell yields. The indication for surgery also significantly affects the isolation outcome. Tissues from donors with benign liver diseases are the most yielding, followed by specimens removed during hepatectomy for secondary and primary tumors, respectively. The indication for surgery is a valuable basis for identifying the specimens with the best expectation concerning the isolation outcome. In addition, we observed that the pre-operative serum level of gamma-glutamytransferase seems to affect the cell function of the freshly isolated hepatocytes. Liver cells from donors with GGT levels >60 U/l showed reduced cell viability, total protein level and albumin production. In order to optimize the cryopreservation outcome, primary human hepatocytes were frozen in culture medium containing 10% DMSO supplemented with varying concentrations of trehalose. Upon thawing of the hepatocytes, cell viability, plating efficiency, total protein, cell proliferation, enzyme leakage, albumin and urea formation as well as phase I and II metabolism were analyzed. Among the concentrations investigated, 0.2 M trehalose showed the best overall outcome. Compared to the single use of DMSO, we found significant improvement in post- thaw cell viability (62.9 ± 13 vs. 46.9 ± 11 %, p < 0.01) and plating efficiency (41.5 ± 18 vs. 17.6 ± 13 %, p < 0.01) in the trehalose group. The use of trehalose as an additional cryoprotective agent resulted in a significantly increased total protein level, higher secretion of albumin and a lower AST level after thawing. The combined application of DMSO and trehalose significantly improves the outcome of human hepatocyte cryopreservation.