dc.contributor.author
Schoene, Claudia
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:37:03Z
dc.date.available
2006-03-13T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/6271
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10470
dc.description
Deckblatt-Impressum
persönlicher Dank
rechtlicher Hinweis
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen
Einleitung
Literatur
Material und Methoden
eigene Untersuchungen und Ergebnisse
Diskussion
Zusammenfassung
Summary
Literaturverzeichnis
Anhang
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
dc.description.abstract
Die vorliegende Studie befaßte sich mit der Aufklärung der Verstoffwechselung
von Dehydroepiandrosteron (DHA), Methandriol (MAD) und 17α-Methyltestosteron
(17α-MT) beim Pferd. Ein weiteres Ziel war darüber hinaus, für die beiden
letzteren, oral-wirksamen Steroide mit anaboler Wirkung eine routinemäßig
anwendbare Screening-Methode im Rahmen der Dopinganalytik zu entwickeln. Dazu
wurden jeweils zwei im Training befindlichen Vollblutrennpferden gleiche
Mengen (200 mg) eines Substanzgemisches der zu untersuchenden Steroidderivate
verabreicht. Für DHA und MAD bestanden diese Gemische zu gleichen Teilen aus
deuterierten und nicht-deuterierten Molekülen, sowie einem radioaktiv-
markierten Isotop (3H-DHA, 14C-DHA, 3H-MAD). 17α-MT wurde lediglich als
deuteriertes / nicht-deuteriertes Substanzgemisch verabreicht. Während drei
bis fünf Tagen nach der Applikation wurden in regelmäßigen Abständen
Blutproben entnommen, sowie der frei abgesetzte Urin gewonnen. Durch
Ermittlung der emittierten ß-Strahlung in den gesammelten Proben, wurden
Resorptions- und Eliminationsverhalten der untersuchten Steroide bestimmt. Zur
labortechnischen Extraktion und anschließenden gaschromatographischen /
massenspektrometrischen (gc/ms)-analytischen Untersuchung gelangten im Rahmen
dieser Arbeit dann lediglich die gesammelten Urinproben. Die Halbwertszeit in
der Eliminationsphase betrug für intramuskulär verabreichtes 3H-DHA zwischen 9
bis 12 Stunden. Die Halbwertszeit des oral verabreichten 14C-DHA lag bei
beiden Pferden bei etwa 3 Stunden. Sie war damit 3 4 mal geringer als bei
intramuskulär verabreichtem DHA. Dies dürfte hauptsächlich durch einen
ausgeprägten hepatischen first-pass effect bei oraler Applikation von 14C-
DHA zu erklären sein. Die Halbwertszeit des oral verabreichten Methandriol
betrug bei einem Pferd 11,99 h und entsprach damit etwa der, von intramuskulär
appliziertem 3H-DHA, d.h. die 17α-Alkylierung stellt vermutlich einen
wirksamen Schutz gegen den first-pass effect der Leber dar. Bei dem zweiten
Pferd betrug die Halbwertszeit von oral verabreichtem 3H-MAD mit 3,75 h jedoch
nur etwa ein Drittel dieses Wertes und war damit eher der Halbwertszeit von
oral verabreichtem 14C-DHA vergleichbar, welches einem first-pass effect
unterlag. Eine Erklärung für diesen großen Unterschied in den Halbwertszeiten
konnte nicht gegeben werden. Die mit dem Urin insgesamt ausgeschiedene Menge
an intramuskulär appliziertem 3H-DHA betrug etwa 60% der verabreichten
Gesamtdosis. Bei oral verabreichtem 14C-DHA und 3H-MAD lag dieser Wert bei
etwa 50%. Der Verlauf der Urinausscheidung von 3H-MAD-Äquivalenten glich
jedoch bei beiden Pferden eher dem, von intramuskulär verabreichtem 3H-DHA.
Bei beiden Steroiden war der Zeitpunkt, zu dem ≥ 95% der über den Urin
ausgeschiedenen Dosis angefallen waren, erst nach etwa 50 Stunden erreicht,
während dies für oral verabreichtes 14C-DHA bereits nach 30 35 Stunden der
Fall war. Bei der Aufarbeitung des mit radioaktivem DHA und MAD markierten
Urins kam es zu großen Verlusten an Radioaktivität und damit an
Analysesubstanz. Diese konnten, trotz mehrfacher Änderung der angewendeten
Extraktionsmethode, nicht wesentlich reduziert werden: Ein Großteil der
verlorenen Radioaktivität fand sich (1) im Anschluß an die Extraktion noch im
Urin, ein weiterer Teil (2) in verschiedenen Lösungen, welche zum Waschen der
Analyseextrakte verwendet worden waren. Die Ursache dieses Phänomens konnte
nicht eindeutig ermittelt werden. Es wurde jedoch die Hypothese aufgestellt,
daß (1) zumindest teilweise durch die ungenügende Kapazität, der zur
Extraktion verwendeten Kartuschen verursacht wurden, während (2) auf das
Vorkommen eines / mehrerer stark hydrophiler Metaboliten zurückzuführen sei,
welche durch die verwendeten hydrophilen Lösungen aus dem lipophilen Extrakten
ausgewaschen wurden. Generell läßt sich feststellen, daß DHA nur zu einem sehr
geringen Anteil unkonjugiert über den Harnweg ausgeschieden wurde (< 2%). Der
weitaus größte Anteil wurde als Konjugat ausgeschieden. Es erfolgte eine
Konjugation zum geringeren Teil mit Glucuronsäure (10-15%) und zum weitaus
größeren Teil mit Schwefelsäure (60%). Auch MAD wurde nur zu einem geringen
Prozentsatz in unkonjugierter Form ausgeschieden (< 4%). Ein Anteil von 10-15%
der Metaboliten wurde als Glucuronsäure-Konjugat ausgeschieden. Der weitaus
größte Teil der bestimmbaren Metaboliten wurde auch in diesem Falle als
Schwefelsäure-Konjugat ausgeschieden (50%). Die gc/ms-Analyse der DHA- und
MAD-Extrakte zeigte aufgrund dieser Verluste nur eine geringe Konzentration
der einzelnen, auffindbaren Metaboliten. Für DHA konnten folgende drei
Metaboliten einwandfrei bestimmt werden: 1\. 3ß-Hydroxyandrost-5-en-17-on 2\.
5-Androsten-3,17-diol 3\. 5-Androstan-3,17-diol Für MAD konnten folgende fünf
Metaboliten einwandfrei bestimmt werden: 1\. 17α-Methyl-5-androsten-3ß,17ß-
diol 2\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androstan-3ß-ol 3\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstan-3,(15/16)-diol 4\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstan-3,(6/7),16-triol 5\. 17-Hydroxy-17α-methyl-
androst-4-en-(6/7),16-diol-3-on Da im Falle des 17α-MT keine radioaktiven
Isotope verabreicht worden waren, unterblieb eine estimmung der
pharmakokinetischen Parameter bei diesem Steroid. Bei der gc/ms-Analyse der
Urin-Extrakte nach oraler Gabe von 17α-MT konnten zahlreiche Metaboliten
gefunden werden, welche z.T. in sehr hoher Konzentration in den
Analyseflüssigkeiten vorkamen. Es wurde deshalb angenommen, daß 17α-MT die für
DHA und MAD beschriebenen Verluste nicht oder nur in sehr viel geringerem
Ausmaß aufwies. Für 17α-MT konnten folgende 12 Metaboliten einwandfrei
bestimmt werden: 1\. 17α-Methyl-17ß-hydroxy-4-androsten-3-on 2\. 17-Hydroxy-
17α-methyl-5-androstan-3-ol 3\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstan-(6/7)-ol-3-on 4\. 17-Hydroxy-17α-
methylandrost-4-en-(6/7)-ol-3-on 5\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androstan-3,(6/7
bzw. 15/16)-diol 6\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androst-3,(6/7)-diol 7\. 17
-Hydroxy-17α-methyl-5-androstan-3,16-diol 8\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstan-3,(6/7),(15/16)-triol 9\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstan-3,(6/7),16-triol 10\. 17-Hydroxy-17α-methyl-
androst-4-en-3,(6/7),(15/16)-triol 11\. 17-Hydroxy-17α-methyl-
androst-4-en-(6/7),16-diol-3-on 12\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstan-(6/7),(15/16)-diol-3-on Voraussetzung für die Etablierung
einer routinemäßigen Nachweismethode für MAD ist die Optimierung des
Extraktionsverfahrens, welches unter den gegebenen Bedingungen nicht für ein
Screening-Verfahren geeignet ist. Für 17α-MT dagegen erwiesen sich die
Metaboliten 2, 6, 7 und 9 als geeignet, bei der gc/ms-Sreening-Analyse eine
mißbräuchliche Anwendung dieses Stoffes beim Pferd nachzuweisen. Mit Hilfe des
'Single Ion Monitoring (SIM)' sollte auf die für 17α-methylierte Steroide
charakteristischen Ionen m/z 143, m/z 218 und m/z 231 untersucht werden. Diese
Methode ermöglicht den Nachweis einer 17α-MT-Anwendung (zu Dopingzwecken) bis
zu einem Zeitraum von mindestens 50 h nach der Applikation. Da im Rahmen
dieser Studie über diesen Zeitraum hinaus keine Urinproben mehr gewonnen
worden waren, sind weitergehende Untersuchungen nötig, um zu bestimmen, bis zu
welchem Zeitpunkt nach der Applikation ein Nachweis der mißbräuchlichen
Anwendung von 17α MT mittels der hier beschriebenen Methode längstens möglich
ist.
de
dc.description.abstract
This study tried to investigate the metabolism of the anabolic steroids
dehydroepiandrosterone (DHA), methandriol (MAD) and 17α-methyltestosterone
(17α-MT) in the Equine and to subsequently develop a gas-chromatographic /
mass-spectrometric (gc/ms) screening method for the detection of the two
latter orally-active anabolic agents. For each experiment 200 mg of the
respective steroid were administered to two thoroughbred horses in training.
The administered substances contained a mixture of the same amount of
deuterated and non-deuterated steroid. Additionally, a radioactive isotop was
administered in the DHA (3H-DHA and 14C-DHA) and MAD (3H-MAD) studies. In the
case of 17α-MT no radioactive isotop was administered. Blood samples were
taken at regular intervals for a three- up to a five-day period. Freely-
voided urine was collected for the same period of time. The absorption and
elimination of the administered steroids were determined by scintigraphy of
the ß-emission in all radio labelled samples collected. Only the urine samples
were subsequently extracted for the detection of possible steroid metabolites
by gc/ms-analysis. The half-life of intramuscularly administered 3H-DHA ranged
from between 9 to 12 h. The half-life of orally administered 14C-DHA was
around 3 h in both horses and hence about ¼ to ⅓ that of 3H-DHA. This can
mainly be explained by the first-pass effect to which orally administered 14C-
DHA had been exposed in the liver. The half-life of orally administered 3H-MAD
was 11.99 h for one of the two horses. This value is similar to the one for
intramuscularly administered 3H-DHA. This would indicate that the 17α-
alkylation has protected the orally administered MAD from the first-pass
effect of the liver. For the second horse the half-life was only 3.75 h, which
is similar to the one for orally administered 14C-DHA being exposed to the
first-pass effect of the liver. This large difference in half-life could not
be explained. Overall, about 60% of the total intramuscularly administered 3H-
DHA was excreted via the urine. For orally administered 14C-DHA and 3H-MAD
this value was about 50%. In 3H-DHA and 3H-MAD ≥95% of the radioactive dose
excreted via the urine had been excreted only after 50 h. For 14C-DHA this
value had already been reached between 30-35 h after administration of the
steroid. The urinalysis of the radioactively labelled steroids showed great
losses of radioactivity, i.e., of steroid metabolites in the urine after
extraction as well as in the solutions used for washing the extracts. Two main
reasons were assumed for these losses: (1) it was thought that losses which
occurred into the urine after extraction were at least partly caused by
capacity problems of the cartridges used; whereas (2) losses into solutions
used for washing the different extracts might have their origin in the
existence of a number of very polar metabolite(s), which were hence washed
out of the lipophilic extracts by the hydrophilic wash solutions used. Due to
these losses the gc/ms analysis of DHA and MAD partly showed rather
unsatisfactory results; most of the detected metabolites were only present in
very low concentrations. This resulted in difficulties to assign the
appropriate chemical structure to a number of the detected metabolites. In
general, DHA and its metabolites were excreted only to a very low percentage
as free steroids (< 2%). About 10-15% were excreted as conjugates with
glucuronic acid while around 60% of the metabolites showed a conjugation with
sulphuric acid. The excretion pattern of MAD and its metabolites showed
similar results; where only around 4% were excreted as free steroid, while
10-15% were excreted as conjugates of glucuronic acid and around 50% as
conjugates of sulphuric acid. The following three metabolites have been
determined for DHA: 1\. 3ß-Hydroxyandrost-5-en-17-one (I = parent drug), 2\.
5-Androsten-3,17-diol (II/4 isomers), and 3\. 5-Androstane-3,17-diol (III/2
isomers). The following five metabolites have been determined for MAD: 1\.
17α-Methyl-5-androsten-3ß,17ß-diol (I/2 isomers = parent drug), 2\. 17
-Hydroxy-17α-Methyl-5-androstane-3ß-ol (II), 3\. 17-Hydroxy-17α-
Methyl-5-androstane-3,(15/16)-diol (IV), 4\. 17-Hydroxy-17α-
Methyl-5-androstane-3,(6/7),16-triol (V/2 isomers), 5\. 17-Hydroxy-17α-Methyl-
androst-4-en-(6/7),16-diol-3-one (VI), as well as Since in the case of 17α-MT
no radioactively labelled isotope had been administered no information could
be obtained about the absorption or excretion profile, the plasma half-life of
the substance or the extent of its phase-II metabolism in the horse. The gc/ms
analysis of this steroid though showed a large number of metabolites present
in the analysed extracts in viable concentrations. It was therefore assumed
that the losses during urinalysis as described for DHA and MAD did not occur
at all or only to a much lesser extend in the case of 17α-MT. The following 12
metabolites have been determined for 17α-MT: 1\. 17α-Methyl-17ß-
Hydroxy-4-androsten-3-one 2\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androstane-3-ol 3\. 17
-Hydroxy-17α-methyl-5-androstane-(6/7)-ol-3-one 4\. 17-Hydroxy-17α-methyl-
androst-4-en-(6/7)-ol-3-one 5\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androstane-3,(6/7 or
15/16)-diol 6\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androst-3,(6/7)-diol 7\. 17-Hydroxy-
17α-methyl-5-androstane-3,16-diol 8\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstane-3,(6/7),(15/16)-triol 9\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstane-3,(6/7),16-triol 10\. 17-Hydroxy-17α-methyl-
androst-4-en-3,(6/7),(15/16)-triol 11\. 17-Hydroxy-17α-methyl-
androst-4-en-(6/7),16-diol-3-one 12\. 17-Hydroxy-17α-
methyl-5-androstane-(6/7),(15/16)-diol-3-one For MAD the prerequisite for the
establishment of a routine detection method is the optimization of the method
used, which in its current form does not yet yield sufficient results viable
to be included into a screening-analysis procedure. For 17α-MT instead the
search for metabolites 2, 6, 7 and 9 during a routine gc/ms screening analysis
is considered sufficient to prove the administration of 17α-MT to the horse
for doping purposes. Using 'single ion monitoring (SIM)' it should be screened
for the fragment ions with the mass-to-charge (m/z) ratios m/z 143, m/z 218
and m/z 231 since they are characteristic for all 17α-methylated steroids.
This method allows the detection of a 17α-MT application to the horse for a
period of at least 50 h after administration. Since in the course of this
study no later urine samples had been collected, additional studies will be
needed to determine the maximum time of detection after administration of 17α-
MT to a horse for doping purposes when using this method of extraction and
analysis.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
17- alkyl steroids
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
UNTERSUCHUNGEN ZUM NACHWEIS UND ZUR BIOTRANSFORMATION EINIGER ORAL WIRKSAMER
17α-ALKYL-STEROIDE MIT ANABOLER WIRKUNG BEIM PFERD
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Angelika Richter
dc.contributor.furtherReferee
PD Dr. Rudolf Scherkl
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Dr. Arthur Grabner
dc.date.accepted
2006-02-10
dc.date.embargoEnd
2006-03-17
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002533-0
dc.title.translated
Metabolism and analysis of selected orally-active 17α-alkyl Steroids with
anabolic potential in the horse
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000002533
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http://www.diss.fu-berlin.de/2006/169/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000002533
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