dc.contributor.author
Diehl, Susanne
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:35:37Z
dc.date.available
2004-12-15T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/6227
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10426
dc.description
0. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 10
1.1. Trypanosoma brucei 10
1.1.1. Schlafkrankheit 10
1.1.2. Krankheitsverlauf und Symptomatik der Schlafkrankheit 11
1.1.3. Diagnose und Therapie 12
1.1.4. Prophylaxe und Vektorkontrolle 13
1.1.5. Phylogenetische Einordung 14
1.1.6. Lebenszyklus 15
1.1.7. Transkription und Regulation der Genexpression 16
1.1.8. Antigenvariation 18
1.1.9. Genomgröße und Organisation 19
1.1.10. Genomprojekte 19
1.2. Funktionelle Genomanalyse 21
1.2.1. Einführung 21
1.2.2. Repräsentative Differenzanalyse 21
1.2.3. DNA-Microarrays 24
1.2.4. Identifikation stadienspezifisch exprimerter Gene von T. brucei 31
2. Material und Methoden 33
2.1. Material 33
2.1.1. Chemikalien 33
2.1.2. Reagenziensätze 35
2.1.3. Enzyme 35
2.1.4. Oligonukleotide 36
2.1.5. Bakterienstämme und Zelllinien 37
2.1.6. Lösungen und Puffer 37
2.1.7. Geräte 39
2.1.8. Verbrauchsmaterial 39
2.1.9. Software und Internetadressen 40
2.1.10. Weitere Materialien und Hilfsmittel 40
2.2 Methoden 41
2.2.1. Kultivierung von T. brucei 41
2.2.2. Isolierung von RNA 41
2.2.3. Repräsentative Differenzanalyse 43
2.2.4. Erstellung von geordneten Klonbibliotheken 48
2.2.5. PCR-Amplifikation von Klonbibliotheken 50
2.2.6. Herstellung von DNA-Arrays 51
2.2.7. Markierung von RNA 53
2.2.8. Hybridisierungen 55
2.2.9. Auswertung von Macroarrays 56
2.2.10. Auswertung von Microarrays 57
2.2.11. RT-PCR Analyse 59
3. Ergebnisse 60
3.1. Repräsentative Differenzanalyse 60
3.1.1. Subtraktive Hybridisierung 60
3.1.2. Isolierung von RDA-Differenzprodukten durch Herstellung geordneter RDA-
Bibliotheken 61
3.1.3. Verifizierung der differentiellen Expression durch Hybridisierung von
cDNA auf RDA-Macroarrays 61
3.1.4. Identifizierung der RDA-Produkte durch Sequenzierung 63
3.2. Trypanosoma brucei Microarray-Analyse 64
3.2.1. Aufbau des Microarrays 64
3.2.2. Datenbearbeitung 68
3.2.3. Validierung der Microarray-Technologie 76
3.2.4. Datenanalyse 79
3.2.5. Identifizierung von stadienspezifischen Genen in der Blutbahnform und
der prozyklischen Form 83
4. Diskussion 91
4.1. Funktionelle Genomanalyse zur Identifizierung stadienspezifischer Gene 91
4.1.1. Allgemeine Fragestellung 91
4.1.2. Repräsentative Differenzanalyse 92
4.2. Optimierung der Datenbearbeitung 95
4.2.1. Normalisierung 95
4.2.2. Datenfilterung 97
4.3. Validierung der Microarray-Technologie 99
4.3.1. Allgemeine Einführung 99
4.3.2. Präzision 99
4.3.3. Akkuratheit der Signalintensitätswerte (Konkordanzanalyse) 100
4.4. Datenanalyse 101
4.4.1. Prüfung auf Normalverteilung 101
4.4.2. Signifikanzanalyse für den Konkordanzdatensatz 102
4.5. Identifizierung und Validierung von stadienspezifischen Genen 103
4.5.1. Experimenteller Aufbau 103
4.5.2. Identifikation differentiell exprimierter Gene 103
4.5.3. Schlußfolgerung und Ausblick 106
5. Zusammenfassung 108
6. Summary 109
7. Literaturverzeichnis 110
dc.description.abstract
Zu den essentiellen Funktionen von Trypanosoma brucei gehört die Anpassung der
verschiedenen Lebensstadien an den jeweiligen Wirt. Die Identifikation von
Genen, die für die im Menschen vorkommenden Blutbahnform spezifisch sind, ist
für die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen die Trypanosomen-Infektion
besonders interessant. In dieser Arbeit sind Gene mit differentieller
Expression in der Blutbahnform und in der prozyklischen Form von T. brucei
durch Repräsentative Differenzanalyse und durch die Anwendung der Microarray-
Technologie identifiziert worden. Für die Microarray-Analyse ist ein
Microarray aus 20.632 genomischen Fragmenten hergestellt worden. Für die
Analyse der Hybridisierungsdaten wurden zunächst die Datenbearbeitung
optimiert. Dazu wurde zuerst die Effizienz zweier verschiedener Verfahren für
die Normalisierung der Hybridisierungsdaten, Mittelwert-Normalisierung und
spotnadelspezifische LOWESS-Normalisierung, verglichen. Nach der
Normalisierung wurde die Filterung der Daten durch den Vergleich der Effizienz
von Signalintensität und Signal/Hintergrund als Kriterium für die
Datenqualität optimiert. Die Akkuratheit und die Präzision der Microarray-
Analyse unter Verwendung der optimierten Datenbearbeitungsmethoden wurde
validiert. Durch die Anwendung der RDA und der Microarray-Analyse konnten
mehrere Gene mit stadienspezifischer Expression in der Blutbahnform und der
prozyklischen Form identifiziert werden. Unter diesen Genen fanden sich
Homologe zu den Oberflächenantigenen der beiden Formen (PARP und VSG) und mit
der Expression der VSG-Gene assoziierte Gene (ESAGs). Neben Genen mit bereits
bekannter differentieller Expression wurden außerdem zahlreiche neue Gene
gefunden. Durch semiquantitative RT-PCR wurde die stadienspezifische
Expression der gefundenen Sequenzen bestätigt.
de
dc.description.abstract
The adaptation of Trypanosoma brucei to its mammalian and insect hosts is an
essential feature of the parasite. The identification of genes that are
uniquely expressed in the human form of the parasite is of particular interest
for the development of new drugs against the T. brucei infection. In this
work, genes that are differentially expressed between the human, bloodstream
and the insect procyclic form of T. brucei were identified using
representational difference analysis (RDA) and microarray technology. For the
microarray analysis, a DNA microarray containing 20,632 genomic fragments was
constructed. Furthermore, the processing of the microarray data was optimized.
First, the efficiency of two different procedures for data normalization � the
mean signal intensities normalization and the normalization through the
pingroupwise application of the LOWESS regression were compared. Second, the
filtering of the data was optimized by testing the signal intensity and the
signal/noise ratio of a spot as a measure for the data quality. Finally, the
accuracy and the precision of the data obtained after normalization and
filtering was validated. Using microarray analysis and RDA, several genes with
differential expression in the bloodstream and the procyclic form were
identified. Some of the differentially expressed genes were related to the
surface antigens VSG and PARP and to the genes that are associated with the
expression of the VSGs in the bloodstream form (ESAGs). Also several novel
genes with stage-specific expression were identified. The stage-specific
expression of these genes was confirmed by semiquantitative RT-PCR.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Trypanosoma brucei
dc.subject
gene expression
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Identifikation differentiell exprimierter Gene der prozyklischen und der
Blutbahn-Form von Trypanosoma brucei durch Repräsentative Differenzanalyse und
Microarray-Technologie
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Hans Lehrach
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Horst Kress
dc.date.accepted
2004-07-01
dc.date.embargoEnd
2005-01-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2004003376
dc.title.translated
Identification of differentially expressed Genes in the procyclic and the
bloodstream form of Trypanosoma brucei by representational difference analysis
and microarray technology
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001399
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2004/337/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001399
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access
