dc.contributor.author
Bahramsoltani, Mahtab
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:31:37Z
dc.date.available
2004-04-13T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/6193
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10392
dc.description
Deckblatt, Inhaltsverzeichnis, Danksagung
1.
Einleitung
8
2. Literaturübersicht
10
3. Zellen und Materialien
53
4. Methoden
61
5. Eigene Untersuchungen
68
6. Diskussion
150
7. Zusammenfassung
179
8. Summary
182
9. Abkürzungen
185
10. Literaturverzeichnis
187
dc.description.abstract
Angiogenese, die Sprossung von Kapillaren aus bereits vorhandenen Blutgefäßen,
ist eine Voraussetzung für Wachstum und Differenzierung von Organen und
Geweben. Gleichzeitig ist Angiogenese an einer Vielzahl pathologischer
Prozesse, wie beispielsweise am Wachstum und der Metastasierung von Tumoren,
beteiligt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine Methode zur
Quantifizierung der Angiogenese und Antiangiogenese in vitro zu etablieren,
die als Ersatz- und Ergänzungsmethode zum Tierversuch alle Phasen der
angiogenen Kaskade umfasst. Des weiteren sollte diese routinemäßig von
verschiedenen Untersuchern und mit einem vertretbaren Zeit- und Kostenaufwand
durchgeführt werden können. Hierfür wurden Endothelzellen aus dem bovinen
Corpus luteum in vitro mit einem Selektivmedium zur Angiogenese stimuliert und
phasenkontrastmikroskopisch untersucht. Dabei zeigten die Endothelzellen im
Ablauf der Angiogenese in vitro charakteristische Veränderungen des Zellbilds
in Form der Aussprossung, linearen Aneinanderreihung, Netzwerkbildung und
schließlich der dreidimensionalen Organisation zu kapillarähnlichen
Strukturen. Diese Phasen der Angiogenese in vitro wurden anschließend anhand
des phasenkontrastmikroskopischen Zellbilds in 8 definierte Stadien
eingeteilt. Der Zeitbedarf dieser Stadien wurde in Tagen gemessen und zur
benötigten Gesamtzeit ins Verhältnis gesetzt. Dadurch war es im Gegensatz zu
den bislang aus der Literatur bekannten in vivo- und in vitro-Modellen
erstmals möglich, den zeitlichen Ablauf der Angiogenese und Antiangiogenese zu
quantifizieren. Zum Nachweis der Reproduzierbarkeit der Methode zur
Quantifizierung der Angiogenese wurde sowohl die Einschätzbarkeit der
definierten Stadien durch unterschiedliche Personen als auch die Homogenität
des Ablaufs der Angiogenese in verschiedenen Kulturschalen geprüft. Dabei
zeigte sich, dass die Einschätzung der Stadien der Angiogenese in vitro durch
zwei verschiedene Untersucher nur geringgradigen Abweichungen unterlag und
somit durch einen einzigen Untersucher durchgeführt werden kann. Die
statistische Bewertung des Ablaufs der Angiogenese in verschiedenen
Kulturschalen, erfasst durch die definierten Stadien, führte zu dem Ergebnis,
dass eine reproduzierbare Quantifizierung der Angiogenese in diesem in vitro-
Modell mit einem relativ kleinen Stichprobenumfang erfolgen kann. Daher ist
die Quantifizierung der Angiogenese und Antiangiogenese in diesem Modell nicht
nur mit einem vertretbaren Zeitaufwand, sondern aufgrund der mittels der
Standardausrüstung eines Zellkulturlabors durchführbaren Untersuchungen auch
mit einem relativ geringen Kostenaufwand verbunden. Im Rahmen dieser Arbeit
erfolgte ein umfangreicher Vergleich der bekannten in vivo-, ex vivo- und in
vitro-Modelle, die zur Identifizierung und Untersuchung pro- und
antiangiogener Faktoren entwickelt wurden. Die für den Einsatz eines in vitro-
Modells der Angiogenese als Ersatz- und Ergänzungsmethode zum Tierversuch
erforderliche Vergleichbarkeit mit der Angiogenese in vivo wurde anhand der
Untersuchung verschiedener Charakteristika der Endothelzellen überprüft. Dabei
zeigte die Morphometrie der sich in vitro gebildeten kapillarähnlichen
Strukturen, dass, wie bei der Angiogenese in vivo, auch der Ablauf der
Angiogenese in vitro mit der Zunahme der Länge, der von diesen Strukturen
eingenommenen Fläche und der Anzahl ihrer Verzweigungspunkte einherging.
Ebenso wiesen die ultrastrukturellen Veränderungen der Endothelzellen im
Ablauf der Angiogenese in vitro Ähnlichkeiten zur Angiogenese in vivo auf.
Diese beliefen sich unter anderem auf Änderungen der Anzahl verschiedener
Zellorganellen, wie beispielsweise der Mitochondrien und des endoplasmatischen
Retikulums. Vor allem aber war ein für die Differenzierung der Endothelzellen
essentielles Merkmal, ihre Polarisierung in eine luminale und eine abluminale
Seite des neugebildeten Gefäßes, zu erkennen. Allerdings deutete die Präsenz
extrazellulärer Matrix im Inneren der kapillarähnlichen Strukturen auf eine
konvertierte Polarität der Endothelzellen hin. Durch den immunzytochemischen
Nachweis von Kollagen Typ IV, einem Bestandteil der Basalmembran, wurde
zusätzlich dokumentiert, dass es sich bei der von den Endothelzellen
sezernierten extrazellulären Matrix um eine der Basalmembran analoge Struktur
handelte. Das Auftreten apoptotischer Endothelzellen, welches im Ablauf der
Angiogenese in vivo ein für die Reifung und Lumenbildung der neuen Kapillare
erforderliches Phänomen darstellt, wurde auch bei den in vitro kultivierten
Endothelzellen beobachtet. Dabei unterlagen gemäß der "umgekehrten" Polarität
vor allem die Endothelzellen, die den kapillarähnlichen Strukturen von außen
auflagen und dadurch keinen Kontakt zur extrazellulären Matrix aufwiesen, dem
programmierten Zelltod. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch die proangiogene
Wirkung von VEGF und FGF-2 mit der etablierten Methode bestätigt und
quantifiziert. Ein besonderer Befund war dabei, dass VEGF in vitro zur Bildung
von Endothelzellsphäroiden führte, welche der Entstehung großlumiger Gefäße in
vivo entsprechen. Auch wurde die in vivo beobachtete Stimulation der
Chemokinese durch FGF-2 bzw. der Chemotaxis durch VEGF bestätigt. Die
Untersuchung und Quantifizierung der Wirkung der Angiogenese-Inhibitoren
Angiostatin und Suramin zeigte, dass sich die Antiangiogenese durch
Angiostatin in einer "Umkehr" der Angiogenese ausdrückt. Suramin hingegen
führte anfangs zu einem beschleunigten Ablauf der Angiogenese. Die anhaltende
Inkubation resultierte jedoch letztlich in der Auflösung der endothelialen
Strukturen und somit in der antiangiogenen Wirkung des Suramin. Das
vorliegende Modell schafft eine Möglichkeit zur praktikablen Quantifizierung
der Angiogenese bzw. Antiangiogenese in vitro. Es kann sowohl zur effektiven
Beurteilung und Quantifizierung der Wirkung potentieller angiogener und
antiangiogener Substanzen, wie auch zur Erforschung dabei ablaufender
zellulärer und molekularer Regulations-mechanismen angewandt werden und bietet
damit die Chance, Tierversuche in Zukunft zu ergänzen und zu ersetzen.
de
dc.description.abstract
Angiogenesis is defined as sprouting of new capillaries from pre-existing
ones. Angiogenesis is a pre-requisite for growth and differentiation of organs
and tissues and is involved in many pathological processes, for example growth
and metastasis of tumours. Up to now numerous in vivo- and in vitro-models of
angiogenesis have been developed in order to identify and analyse pro- and
antiangiogenic factors. In these models, the effects of the substances tested
were quantified in a few phases of angiogenesis only. The aim of the present
study was to establish a method to quantify angiogenesis and antiangiogenesis
in vitro in order achieve a replacement and complementary method comprising
all stages of the angiogenic cascade. Furthermore, routinely accomplishment of
quantitation should be possible for different investigators with a
maintainable effort of time and costs. Endothelial cells derived from the
bovine corpus luteum have been incubated in a selective medium, and the
resulting angiogenic reaction of these cells was examined by phase contrast
microscopy. In the course of in vitro angiogenesis, endothelial cells showed
characteristic changes in their cellular morphology, i.e. sprouting, linear
side by side arrangement and three-dimensional organisation in capillary-like
structures. Subsequently, these phases of angiogenesis in vitro have been
divided into eight strictly defined stages. Thus, in contrast to previously
described in vivo and in vitro models, quantitation of the temporal course of
angiogenesis and antiangiogenesis was established. The reproducibility of
quantitation of angiogenesis was verified by examination of the defined stages
by different persons and investigation of homogeneity of the course of
angiogenesis in different culture dishes. Assessment of the stages of
angiogenesis by two different investigators showed only minimal variances, and
can therefore be established by a single investigator. The statistical
evaluation of the course of angiogenesis in different culture dishes assessed
by the defined stages of angiogenesis showed that a small sample size only is
needed for quantitation of angiogenesis in this model. Thus, quantitation of
angiogenesis and antiangiogenesis is not only time-efficient, but the method
may also be performed with standard equipment of most cell culture
laboratories and is thus additionally cost-efficient. Within the scope of this
study, as previously described in vivo, ex vivo and in vitro-models employed
for identification and testing of pro- and anti-angiogenic factors were
compared in extension. In case an in vitro-model should be employed to reduce
or replace animal testing, comparability to angiogenesis in vivo is essential
and was established by examination of several characteristics of the cultured
endothelial. The morphometry of capillary-like structures in vitro showed an
increase of the area occupied, the length and the number of branching points
in the course of angiogenesis. The ultrastructural changes of the endothelial
cells in the course of angiogenesis in vitro showed analogies to angiogenesis
in vivo, for example, a change in the number of cell organelles like
mitochondria and endoplasmic reticulum occurred. Above all, an essential
attribute of differentiated endothelial cells, their polarisation in the
context of angiogenesis, was observable. However, the presence of
extracellular matrix inside the capillary-like structures suggested a
converted polarity of endothelial cells. The immunocytochemical investigation
of collagen type IV demonstrated that endothelial cells secreted a
characteristic component of the basal membrane. The appearance of apoptotic
endothelial cells, a sign of capillary maturation in vivo, was also observed
in cultured endothelial cells. According to the converted polarity of the
endothelial cells, apoptosis was detected in cells at the exterior side of
capillary-like structures, where cells lost contact to the extracellular
matrix. In this study, proangiogenic effects of "Vascular Endothelial Growth
Factor" (VEGF) and "Fibroblast Growth Factor-2" (FGF-2) were established and
quantified by the newly developed method. A particularly noteworthy result was
the observation that VEGF induces formation of endothelial spheroids in vitro,
equivalent to large-calibre vessels in vivo. Additionally, the reports from in
vivo studies of stimulation of chemokinesis induced by FGF-2, and chemotaxis
induced by VEGF, respectively, were verified. Examination and quantitation of
the angiogenesis-inhibitors Angiostatin and Suramin detected that Angiostatin-
induced antiangiogenesis resulted in an 'inverse' angiogenesis. Suramin, on
the other hand, initially resulted in increased angiogenesis. Long-term
incubation ultimately resulted in disintegration of endothelial structures and
thus established the antiangiogenic properties of Suramin. In conclusion, the
present model allows a viable quantitation of angiogenesis and
antiangiogenesis in vitro. It can be employed either in trial studies of
potential angiogenic and antiangiogenic substances, respectively, or in the
investigation of their essential cellular and molecular mechanisms and may
thus provide an efficient method to reduce, refine and replace animal testing.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
antiangiogenesis
dc.subject
in vitro-model
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Quantifizierung der Angiogenese und Antiangiogenese in vitro
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. J. Plendl
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. H. Weiß
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. K. Müller
dc.date.accepted
2004-01-06
dc.date.embargoEnd
2004-05-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2004001105
dc.title.translated
Quantitation of angiogenesis and antiangiogenesis in vitro
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
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FUDISS_thesis_000000001279
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http://www.diss.fu-berlin.de/2004/110/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001279
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