dc.contributor.author
Adams, Stephanie Caroline Johanna
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:31:00Z
dc.date.available
2009-02-04T08:45:06.836Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/6182
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10381
dc.description.abstract
Die Receptor Interacting Proteins (RIPs) übernehmen als zytoplasmatische
Adaptorproteine insbesondere des TNF-Rezeptors Typ I fundamentale Funktionen
bei der intrazellulären Feinabstimmung lebenswichtiger Prozesse. Während für
RIP4 bereits eine essentielle Rolle bei der embryonalen Entwicklung
ektodermaler Gewebe nachgewiesen wurde, war ansonsten über die Bedeutung
dieser Proteinfamilie für die Haut sowie deren Wundheilung vor Beginn dieser
Arbeit nichts bekannt. Dabei erfordert insbesondere die Verletzung des
feinstrukturierten Gewebes der Haut eine komplexe Reorganisation, welche über
exakt abgestimmte Mechanismen durch eine Vielzahl beteiligter Zelltypen
gesteuert wird. Dies erfolgt in einem hohen Maße über die Freisetzung von
Wachstumsfaktoren und Zytokinen, deren Signale über unterschiedliche
Rezeptoren in das Zellinnere weitergeleitet werden. Aufgrund der besonderen
Bedeutung der Rezeptoren vom TNFR-Typ für den Wundheilungsprozess war es das
Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit, die keratinozytenspezifische Bedeutung
der RIPs in der Haut sowie bei der Wundheilung zu analysieren. Hierfür wurde
zunächst die basale Expression der einzelnen rip-Gene im intakten Hautgewebe
sowie deren Regulation im Heilungsverlauf muriner Exzisionswunden untersucht.
Bei diesen in vivo-Expressionsanalysen wurde keine Regulation der moderat
exprimierten rip-Gene 1, 2 und 5 beobachtet. Demgegenüber ließ sich für das
rip3-Gen eine massive Induktion während der inflammatorischen Phase der
Wundheilung nachweisen, welche sich in den Zellen des Granulationsgewebes
lokalisieren ließ. Hingegen wurde für das in den Keratinozyten der
Basalschicht stark exprimierte rip4-Gen eine massive Repression während der
frühen Wundheilung beobachtet, die sich in den Keratinozyten des
hyperproliferativen Epithels lokalisieren ließ. Darauf aufbauend wurden zudem
die Expressionsmuster der rip-Gene unter proliferations- sowie
differenzierungsförderlichen Kultivierungsbedingungen von Keratinozyten in
vitro untersucht. Auch hierbei ließ sich keine Regulation der Expression der
rip Gene 1, 3 und 5 nachweisen, während das Expressionsniveau des rip2-Gens
bei HaCaT-Zellen mit deren Proliferationsrate korrelierte, was sich jedoch in
primären Keratinozyten nicht bestätigen ließ. Die Expression des rip4-Gens
wies hingegen sowohl in HaCaT-Zellen als auch in primären Keratinozyten eine
enge Assoziation mit der frühen Differenzierung auf, womit sich bereits
andeutete, dass RIP4 an der Regulation der Keratinozytendifferenzierung
beteiligt sein könnte. Vor diesem Hintergrund wurde in vitro untersucht,
welche Faktoren an der Repression des rip4-Gens in Keratinozyten nach
Verwundung beteiligt sein könnten. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sehr
unterschiedliche Faktoren, welche größtenteils auch wichtige Regulatoren der
Wundheilung in vivo sind, eine Repression der rip4-Genexpression bewirken
können: sowohl Serum als auch EGF, TGF-β1, Activin A, proinflammatorische
Zytokine und Wasserstoffperoxid führten zu einer Hemmung der rip4-Expression.
Diese Hemmung ließ sich jedoch teilweise durch Inhibitoren des
Transkriptionsfaktors NF-κB blockieren, wobei sich insbesondere nach
Applikation von Dexamethason eine komplette Aufhebung der rip4-Genrepression
nach Verwundung in vitro nachweisen ließ. Begleitet wurde diese Dysregulation
von einem vollständig unterbleibenden Wundverschluss der Keratinozyten-
Monokultur, was auf eine besondere Bedeutung der Regulation der
rip4-Expression für die Reepithelisierung nach Verwundung hinweist. Zur
näheren Charakterisierung der funktionellen Bedeutung von RIP4 in
Keratinozyten wurde schließlich die Expression des rip4-Gens in kultivierten
HaCaTZellen mittels siRNA gehemmt. Anschließende Untersuchungen der
Keratinozyten zeigten, dass die Hemmung der rip4-Genexpression weder eine
veränderte Proliferationsrate noch eine Regulation von
proliferationsassoziierten Genen nach sich zog. Demgegenüber ließ sich
insbesondere für Gene, welche mit der frühen und mittleren
Differenzierungsphase von Keratinozyten assoziiert sind, eine temporär
induzierte Expression nachweisen. Zusammen mit den Ergebnissen der in vivo-
Analysen zur Lokalisation der rip4-Genexpression im Hautgewebe konnte somit
gezeigt werden, dass das RIP4-Protein an der Regulation der frühen
Differenzierung von Keratinozyten beteiligt ist. Zudem konnte nachgewiesen
werden, dass RIP4 die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB in
Keratinozyten bewirkt. Da auch über die Bedeutung von NF-κB für die
Wundheilung der Haut vor Beginn dieser Arbeit wenig bekannt war, wurde auch
dessen Aktivierung im Verlauf der Wundheilung untersucht. Hierbei konnte
gezeigt werden, dass die Aktivität von NF-κB bei der Wundheilung der Haut
einer differentiellen Regulation unterliegt. Insbesondere in Zellen des
Granulationsgewebes sowie des hyperproliferativen Epithels ließ sich eine
massive Aktivierung nachweisen. Wundheilungsstudien an IκBαDN-Mäusen, in denen
die Aktivität des NF-κB auf ein Minimum reduziert ist, zeigten zudem, dass die
mangelnde NF-κBAktivierung zu einem ausgeprägten inflammatorischen
Wundheilungs-Phänotyp führt, der mit einer verminderten Ausbildung des
hyperproliferativen Epithels einhergeht. Ähnlich wie nach Dexamethason-
Applikation in vitro führte die eingeschränkte NF-κB-Aktivität zudem auch in
vivo zu einer stagnierenden, hohen Expression des rip4-Gens nach Verwundung.
Insgesamt konnte somit nachgewiesen werden, dass die Gene, die für die
verschiedenen Receptor Interacting Proteins kodieren, in Keratinozyten
charakteristische Expressionsmuster aufweisen. Während rip1-3 sowie rip5
größtenteils lediglich moderat exprimiert und nicht reguliert werden,
unterliegt das rip4-Gen einer komplexen Regulation und übernimmt in
Keratinozyten eine bedeutende Funktion sowohl bei der Reepithelisierung nach
Verwundung als auch bei der epidermalen Differenzierung.
de
dc.description.abstract
Receptor Interacting Proteins (RIPs) were initially identified as adapter
proteins of the intracellular domain of members of the TNFR I family.
Meanwhile, they are known to be crucial integrators of intracellular vital
processes and central regulators of cell proliferation and differentiation.
Although a previous publication could demonstrate that RIP4 is an important
modulator of ectodermal tissue formation during embryonic development, nothing
was known about a potential role of the RIP proteins in cutaneous wound
healing and epidermal differentiation at the beginning of our study. Cutaneous
wound repair requires a tight and coordinated regulation of various different
processes, such as cell proliferation, differentiation, and migration. This
egulation is performed by a complex system of growth factors and cytokines,
which bind to various types of specific receptors and thus initiate complex
signal transduction pathways. Due to the particular importance of receptors of
the TNFR type for cutaneous wound healing, the aim of this thesis was to
analyse the role of the Receptor Interacting Proteins in the regeneration and
differentiation of the epidermal tissue. Initially, basal expression patterns
of the rip genes in skin tissue and their regulation after wounding were
analysed via Northern blot. Even though there was no obvious regulation of the
moderately expressed genes of rip1, 2 and 5, a strong induction of rip3 gene
expression was observed during the inflammatory stage of wound healing.
Further analysis using the immunofluorescence technology could show that this
was primarily due to increased expression in the granulation tissue. By
contrast, the intense rip4-expression seen in intact skin was strongly
downregulated early after wounding, particularly in the keratinocytes of the
hyperproliferative epithelium. These results could be confirmed after scratch-
wounding of keratinocytes in vitro. Furthermore, the patterns of rip gene
expression were analysed in proliferating and differentiating keratinocytes in
vitro. Whereas expression levels of the rip1, 3 and 5 genes were unaltered
upon differentiation, rip2-expression was decreased in differentiating HaCaT-
cells but not in differentiating primary keratinocytes. Upregulation of rip4
gene expression was associated with the early differentiation stage of both
cell types, suggesting a role of RIP4 in keratinocyte differentiation. Based
on these findings, the regulation of rip4 gene expression by different
biological factors was studied in cultured keratinocytes in vitro. For this
purpose, cells were treated with various growth factors and cytokines. Thus,
we could show that a broad variety of factors such as whole serum, as well as
EGF, TGF-β, Activin A, proinflammatory cytokines and reactive oxygen species
lead to a repression of rip4 gene expression . Interestingly, this repression
could be at least partially abolished by factors which act as inhibitors of
the transcription factor NF-κB. Particularly, treatment with the
glucocorticoid dexamethasone totally blocked the scratch-induced repression of
rip4 gene, accompanied with an absence of reepithelialisation of the wounded
keratinocytes, indicating a pivotal role of rip4 gene downregulation after
wounding. To get further information about the precise function of RIP4 in
epidermal keratinocytes, additional studies using specific siRNA were
performed. Despite the fact that inhibition of rip4 gene expression had no
effect on keratinocyte proliferation, a temporary induction especially of
early markers of keratinocyte differentiation was observed in rip4-mRNA
deficient cells, confirming the essential role of this protein in epidermal
homeostasis. Finally, it could be demonstrated that activation of the
transcription factor NF-κB is dependent on rip4 gene expression in
keratinocytes. Since at the beginning of this study, nothing was known about
the role of NF-κB in cutaneous wound healing, the activation patterns of this
transcription factor in murine excisional wounds were determined: Thereby, we
observed a strong NF-κB activation in certain cells of the granulation tissue,
as well as in the keratinocytes of the hyperproliferative epithelium.
Consistently, wounding of transgenic mice expressing a dominant negative
inhibitor of NF-κB resulted in a distinct inflammatory phenotype, accompanied
by a slightly delayed formation of the hyperproliferative epithelium. In
addition, the restricted NF- κB activation in vivo led to constitutive
expression of rip4 gene after wounding, as observed after dexamethasone
application and wounding in vitro. In summary, it was shown that rip genes are
differentially expressed in cutaneous wound repair and keratinocyte
differentiation. Whereas most rip genes are only slightly expressed and not
regulated in keratinocytes, it could be shown that RIP4 is an important
modulator of epidermal regeneration upon wounding and a crucial regulator of
keratinocyte differentiation.
en
dc.format.extent
[4], 137 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Cell differentiation
dc.subject
Receptor-Interacting Protein Serine- Threonine Kinases (MeSH)
dc.subject
NF-kappa B (MeSH)
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft
dc.title
Receptor interacting proteins
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Dr. rer. nat. Ralf Einspanier
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. rer. nat. Barbara Munz
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Heike Tönhardt
dc.date.accepted
2008-07-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000007346-6
dc.title.subtitle
die Rolle der NF-κB-Aktivatoren bei der Wundheilung der Haut und der
epidermalen Differenzierung
dc.title.translated
Receptor Interacting Proteins
en
dc.title.translatedsubtitle
the role of the NF-κB-activators in cutaneous wound healing and epidermal
differentiation
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000007346
refubium.note.author
Mensch und Buch Verlag; 978-3-86664-513-4
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005019
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access