Der nierenspezifische, furosemidsensitive Natrium-Kalium-Chlorid-Kotransporter Typ 2 (NKCC2) ist für die transepitheliale Natriumchlorid Reabsorption in der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (TAL) verantwortlich und somit für die Salz- und Volumenhomöostase des Körpers essentiell. Die Transportaktivität von NKCC2 ist unter anderem von seiner N terminalen Phosphorylierung, seiner apikalen Translokation sowie seiner Assoziation mit Lipid Raft Membranmikrodomänen abhängig. Vasopressin (AVP) stimuliert diese Parameter im Kontext einer gesteigerten Urinkonzentrierung effektiv. Experimentell induzierter hypotonischer Chloridmangel-Stress erzeugt die gleichen Effekte. Dabei wurden zugrundeliegende Mechanismen und interagierende Proteine, die in die Regulation der NKCC2-Aktivität involviert sind, bislang nur wenig untersucht. Um einen besseren Einblick in diese Mechanismen zu erhalten, wurden mittels massenspektrometrischer Analysen potentielle Interaktionspartner von NKCC2 identifiziert. Dazu wurden detergensresistente Membranfraktionen aus einer Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation als Ausgangsmaterial für eine NKCC2-Immunpräzipitation eingesetzt. Auf diese Weise wurde, neben anderen Proteinen, das Scaffolding Protein Annexin A2 (ANXA2) als ein neuer Interaktionspartner von NKCC2 in Lipid Rafts identifiziert. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass ANXA2 nicht nur in die Formation von Lipid Rafts involviert ist, sondern auch die Lipid Raft-abhängige Translokation verschiedener Membranproteine, wie Aquaporin 2, vermittelt. Folglich wurde hier die Hypothese, dass ANXA2 eine wesentliche Rolle bei der Rekrutierung von NKCC2 in Lipid Rafts sowie seiner apikalen Translokation einnimmt, aufgestellt. Mit Hilfe morphologischer Methoden wurde eine Kolokalisation von ANXA2 sowie seinem etablierten Komplexpartner P11 (S100A10) mit NKCC2 in den als Rafts identifizierten, apikalen Membrandomänen des TAL gezeigt. Bindungsstudien belegten, dass ANXA2, jedoch nicht P11, direkt mit dem unphosphorylierten N-Terminus von NKCC2 interagiert. Zudem stimulierte allein ANXA2, und nicht P11, die AVP- oder Chloridmangel-Stress-induzierte, apikale Translokation von NKCC2 in einem Tiermodell mit zentralem Diabetes insipidus und in Zellkultur. Die Verminderung der Abundanz von ANXA2 mittels siRNA limitierte die durch Chlorid-Depletion hervorgerufene Akkumulation von NKCC2 in der Plasmamembran, was die Rolle von ANXA2 bei der apikalen Translokation von NKCC2 unterstützt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass ANXA2 ein essentieller, Lipid Raft-gekoppelter Translokationsfaktor ist, der unter Einsatz etablierter Stimuli direkt die apikale Translokation des Kotransporters NKCC2 vermittelt. Diese Studie liefert somit neue mechanistische Informationen über die Regulation von NKCC2.
The renal furosemide-sensitive Na-K-Cl-cotransporter type 2 (NKCC2) is responsible for transepithelial sodium-chloride reabsorption in the thick ascending limb (TAL) and thus critical to body salt handling and urinary concentration. Transport activity of NKCC2 depends, among other variables, on its N-terminal phosphorylation, its rate of apical trafficking, and on its association with lipid raft membrane microdomains. Vasopressin (AVP) effectively stimulate these parameters in the context of an enhanced urine concentration. Experimentally induced low chloride hypotonic stress has similar effects. Underlying mechanisms and interacting proteins involved in the activation of NKCC2 have so far received only limited attention. To gain better insight into these mechanisms, a mass spectrometric screen was performed to identify potential binding partners of NKCC2 using detergent- resistant membrane fractions from sucrose density gradient centrifugation. Fractions were used for immunoprecipitations with antibody to NKCC2. Among other proteins, the scaffolding protein annexin A2 (ANXA2) was hereby identified as a novel protein interacting with NKCC2 in lipid rafts. ANXA2 is known to stabilize lipid rafts and to mediate lipid raft-dependent trafficking of several membrane proteins such as aquaporin 2. We hypothesized that ANXA2 serves as an essential mediator in the recruitment of NKCC2 into lipid rafts and apical trafficking. With morphological methods we could demonstrate that ANXA2 and its complex-forming partner, P11 (S100A10), are co-distributed with NKCC2 in TAL apical membrane domains identified as rafts. Binding assays revealed direct interaction between ANXA2, but not P11, and the N terminus of NKCC2 in its dephosphorylated state. ANXA2, but not P11, further served to promote apical trafficking of NKCC2 in response to AVP or low chloride hypotonic stress in a rat model for central diabetes insipidus and in cultured cells. RNAi-induced knockdown of ANXA2 revealed that the plasma membrane localization of NKCC2 was limited in absence of ANXA2 during low chloride stimulation, supporting its role in apical trafficking of the cotransporter. In summary, our data have identified ANXA2 as an essential, lipid raft-related trafficking factor which directly promotes the apical trafficking of the cotransporter, NKCC2, in response to established stimuli. This study hereby provides new mechanistic information on the regulation of NKCC2.
