Swine influenza (SI) is a highly contagious viral infection in pigs and is characterized by mild to severe illness, which can lead to death under certain circumstances. The disease is caused by SIV, which belongs to the influenza A virus genus in the Orthomyxoviridae family. The newly emerged pandemic influenza A(H1N1) 2009 virus appears to be a result of reassortment of classical swine H1N1, human H3N2, avian and Eurasian swine influenza viruses. The newly emerging virus is genetically and antigentically different from circulating seasonal H1N1 influenza A virus. SI is not only an important respiratory pathogen in pigs but also a potential threat to human health. An effective vaccine may protect the pork industry from economic losses and curb the development of new virus variants that may threaten public health. Immunization with inactivated vaccines has long been the main strategy for the prevention of influenza infections. However, approaches other than conventional vaccines have also been found to induce protective immunity against infection, the most prominent being recombinant containing the envelope glycoproteins of the H1N1 virus. Therefore, this study aimed at the design, validation and development of a production process for a recombinant hemagglutinin (HA) influenza vaccine for the prevention of pandemic influenza A(H1N1)09 infection. The viral surface protein HA is the key antigen in the host response to influenza virus since neutralizing antibodies directed against HA can mitigate or prevent infection. The equine herpesvirus type 1 (EHV-1) was selected as modified live vector (MLV) for the synthesis of recombinant H1 of pandemic influenza A(H1N1). EHV-1 has recently been demonstrated to be a promising alternative viral vehicle for delivery of foreign antigens. In the second and third chapter of the thesis, we report on the construction of an equine herpesvirus 1 that expresses H1 of pandemic influenza A(H1N1)09 (rH_H1) and the evaluation of its efficacy as a vaccine in mouse model of influenza virus and in the natural host (pigs). Immunofluorescence and western blotting demonstrated expression of the recombinant protein and the in vitro growth properties of the modified live vector were found to be comparable to those of the parental virus. After immunization of mice, the rH_H1 vaccine induced an influenza virus-specific antibody response. Upon challenge infection, protection of vaccinated mice and natural host (pigs) could be demonstrated by reduction of clinical signs of the disease, reduction of virus replication as evidenced by decreased nasal virus shedding and faster virus clearance. Taken together, our results indicated that recombinant EHV-1 encoding H1 of pandemic influenza H1N1 may be a promising alternative for protection of pigs against infection with pandemic influenza A(H1N1)09 or other influenza viruses. Highlights points of the thesis ► Equine herpesvirus type 1 robustly expresses hemagglutinin of pandemic H1N1 (swine influenza virus). ► Mice and pigs are clinically protected against challenge infection after vaccination. ► Vaccine was utilized with no purification or adjuvant. ► Viral loads are reduced in vaccinated versus non-vaccinated animals. Key word Recombinant vaccine, EHV-1, Vector, Pandemic Influenza H1N1, Hemagglutinin, Mice, Pigs.
Die Influenza der Schweine (SI) ist eine hoch ansteckende Erkrankung, die durch milde bis schwere Krankheitsverläufe gekennzeichnet ist und unter bestimmten Umständen zum Tod des Tieres führen kann. Die Erkrankung wird durch das SI-Virus ausgelößt, welches innerhalb der Familie Orthomyxoviridae zu dem Genus Influenza A gezählt wird. Das neuauftretende, pandemische Influenzavirus A(H1N1)09 scheint das Resultat eines genetischen Rekombinationsvorganges zwischen der klassischen “Schweinegrippe” H1N1, dem humanen H3N2-Virus, aviären Influenzaviren sowie eurasischen Influenzaviren von Schweinen zu sein. Dadurch unterscheidet sich das Virus genetisch sowie antigenetisch von dem saisonal zirkulierenden H1N1-Influenzavirus A. Das SIV ist dabei nicht nur ein wichtiges Pathogen des respiratorischen Traktes der Schweine sondern stellt auch eine potentielle Bedrohung für den Menschen dar. Diesbezüglich sollte ein effektiver Impfstoff die industrielle Schweinezucht auf der einen Seite vor ökonomischen Verlusten bewahren und auf der anderen Seite die Entwicklung neuer Virusvarianten, welche die menschliche Gesundheit bedrohen können, unterbinden. Die Immunisierung mit inaktivierten Todimpfstoffen war für lange Zeit die Hauptmaßnahme zur Prävention von Influenzainfektionen. Aber auch für andere Impfstrategien konnte die Auslösung einer protektiven Immunantwort gegen die virale Infektion gezeigt werden. Im Vordergrund stehen hierbei rekombinante Vektoren, welche für Glykoproteine der Virushüllmembran des H1N1-Virus kodieren. Daher zielt diese Studie auf das Design, die Validierung und Entwicklung eines Produktionsprozesses zur Herstellung von rekombinaten Influenza-Hämagglutinin-Vakzinen. Das virale Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) stellt eines der entscheidenen Antigene in der Ausbildung der Immunantwort des Wirts dar weil entsprechende neutralisierende Antikörper die Infektion abschwächen oder gänzlich verhindern können. Zur Expression des rekombinanten H1 des pandemischen Influenzastammes H1N1 wurde das equine Herpesvirus-1 (EHV-1) als modifizierter Lebendvektor (MLV) verwendet. In Publikationen konnte kürzlich gezeigt werden, dass EHV-1 ein vielversprechendes Vehikel für die intrazelluläre Produktion fremder Antigene darstellt. Das zweite und dritte Kapitel der Promotionsarbeit befasst sich mit der Konstruktion eines equinen Herpesvirus-1, welches das H1 des pandemischen Influenzavirus A(H1N1)09 (rH_H1) exprimiert, sowie der Beurteilung seiner Effizienz als Impfstoff im Mausmodell der Influenzainfektion und Infektionen des Schweins. Die Expression des rekombinanten Proteins konnte durch indirekte Immunofluoreszenzmikroskopie sowie Western Blot Analyse nachgewiesen werden. Zudem wies der modifizierte Lebendvektor im Vergleich zum parentalen Wildtypvirus keine Unterschiede bezüglich seiner Replikation in vitro auf. Die Immunisierung von Mäusen mit dem rH_H1 induzierte eine Influenzavirus- spezifische Antikörperantwort. Der Schutz von geimpften Mäusen und Schweinen nach einer challenge- Infektion konnte durch Verminderung der klinischen Symptome nachgewiesen werden. Auch die Virusreplikation in geimpften Tieren war beinträchtigt, wie durch eine reduzierte, nasale Ausscheidung und schnellere Beseitigung des Virus gezeigt werden konnte. Zusammenfassend implizieren die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass ein rekombinantes, H1-exprimierendes EHV-1 eine vielversprechende Alternative zur Immunsierung von Schweinen gegen das pandemische Influenzavirus A (H1N1)09 oder anderer Influenzaviren darstellt. Hauptergebnisse der Promotionsarbeit ► Ein rekombinates, equines Herpesvirus-1 ist zur robusten Expression des Hämagglutinin des pandemischen H1N1 (Influenzavirus der Schweine) befähigt. ► Mäuse und Schweine sind nach Immunisierung mit dem Impfstoff gegen die Influenzainfektion geschützt. ► Das Vakzine kann ohne vorherige Aufreinigung oder Zugabe von Adjuvanz verwendet werden. ► Die virale Belastung ist in geimpften gegenüber ungeimpften Tieren reduziert. Schlüsselwörter Rekombinante Vakzine, EHV-1, Vektor, pandemische Influenza H1N1, Hemagglutinin, Mäuse, Schweine.