Isolation und Identifikation glykopeptidresistenter Enterokokkenspezies aus Mastgeflügel

Abstract

In den letzten Jahren gewinnen einige Stämme der Gattung Enterococcus als fakultativ patho-gene Erreger in der Humanmedizin an Bedeutung. Während noch vor 10 Jahren Enterokokken nicht zu den nosokomialen Sepsiserregern zählten, werden sie heute bereits für ca. ein Fünftel der septischen Allgemeininfektionen verantwortlich gemacht. Dieser Anstieg begründet sich vor allem auf ihrer besonderen Fähigkeit, Resistenzen gegenüber antimikrobiell wirksame Substanzen auszubilden. Entsprechende Untersuchungen ergaben natürliche Resistenzen gegen Cephalosporine, Aminoglykoside, Polymyxine und Makrolidantibiotika sowie erworbene Empfindlichkeiten gegenüber Tetracyclinen, Chloramphenicol sowie Glykopeptiden und Chinolonen, wobei letztere nur mäßig ausgeprägt ist. Mit diesem Phänomen verbindet sich das aktuelle Versagen von Reserveantibiotika wie Vancomycin und Teicoplanin in der Intensiv-medizin. Die hohe Glykopeptidunempfindlichkeit wird durch die Präsenz des high-level Resistenzgens VanA gekennzeichnet. Diese high-level Resistenz wird mittels Transposonen übertragen. Sie äußert sich in einer durch Vancomycin und Teicoplanin induzierbaren Unempfindlichkeit mit einer MHK von >256 µg/ml. Ziel der Studie war es, Vorkommen und Empfindlichkeit Vancomycin-resistenter Entero-kokken (VRE) zu erfassen sowie Zusammenhänge zwischen Glykopeptidresistenzen und dem Einsatz von Avoparcin in der Tierproduktion aufzuzeigen. Das Glykopeptid Avoparcin wurde in der Tiermast als Leistungsförderer eingesetzt und weist eine dem Teicoplanin und Vancomycin ähnliche Struktur auf. Allerdings ist seit Januar 1996 diese Applikation gesetzlich unterbunden worden, da man die Entwicklung von Kreuzresistenzen und Resistenzpools fürchtete. Die untersuchten Proben stammten aus Geflügelmastbetrieben. Zur Klärung möglicher Zu-sammenhänge zwischen Avoparcinverfütterung und Resistenzverhalten wurden Betriebe zweier unterschiedlicher Haltungsformen ausgewählt: Einerseits konventionell, also potentiell mit dem Einsatz von Avoparcin (bis zu dessen Verbot) als Futtermittelzusatz arbeitende Großbetriebe und andererseits ökologisch, also unter dem Verzicht von Fütterungsarznei-mitteln produzierende Kleinbetriebe. Um ein möglichst breites Spektrum der Infektionskreise zu erfassen, wurden die Proben aus den Bereichen Stall, Schlachthof und Lebensmittelendprodukt gezogen. Es wurden insgesamt 223 Proben entnommen und 281 VRE-Stämme isoliert. Zunächst wurde von allen VRE-Stämmen nach kulturmorphologischen, biochemischen und serologischen Kriterien die Artzugehörigkeit bestimmt. Anschließend wurde die Glykopeptidempfindlichkeit im Mikrodilutionsverfahren geprüft. Bei 48, auf grund von Herkunft, Haltungsform und Resistenzverhalten ausgewählten Isolaten, wurde mittels PCR das VanA-Gen nachgewiesen. Von diesen Isolaten wurde eine horizontale Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt, und die Gele durch eine Clusteranalyse mit dem Programm Gelcompar 3.1 ausgewertet. 60,1% der Gesamtproben erwiesen sich bei Anzüchtung auf einem mit 50 mg Vancomycin/l supplementierten CATC-Agar als VRE positiv. Bei den Proben kleinbäuerlicher Haltung fielen 30,5% VRE-positiv aus, hingegen 87,8% der Proben konventioneller Großbetriebe. Bei den VRE-Isolaten handelte es sich ausschließlich um E. faecium-Stämme mit einem high-level Resistenzverhalten. Das VanA-Gen wurde bei allen ausgewählten Isolaten nachgewiesen. Die Clusteranalyse zeigte eine Übereinstimmung der Proteinmuster von mehr als 90% und weist damit einen hohen verwandtschaftlichen Grad nach.

In the field of human medicine in recent years, several strains of the enterococcus species have been gaining significance as facultative pathogenic agents. While as recently as 10 years ago enterococci did not figure as nosocomial septic agents, today they are held responsible for some fifth of all general septic infections. This rise is attributable above all to the special capability of these agents to develop resistance to substances with anti-microbial effects. Studies of these agents describe their natural powers of resistance to cephalosporins, aminoglycosides, polymyxins and macrolidantibiotics, acquired powers of resistance to tetracyclines, chloramphenicol and glycopeptides, and merely moderate sensitivity to chinolones. An associated effect in intensive medicine is the current failure of reserve antibiotics such as vancomycin and teicoplanin. This high degree of insensitivity to glycopeptides is characterized by the presence of the high-level resistance gene VanA. With transposones, this high- level resistance demonstrates a transferrable resistance with an MHK of more than 256 µg/ml; the same level of inducible resistance is achieved with vancomycin and teicoplanin.

The target of the study was to demonstrate the incidence and resistance behaviour of vanycomycin-resistant enterococci (VRE), as well as the connections between powers of resistance to glycopeptide and the deployment of Avoparcin in livestock production. Avoparcin is likewise a glycopeptide; it was used in livestock breeding as performance booster and has a structural formula similar to that of Teicoplanine and Vancomycin. Since January 1996, however, the usage of Avoparcin has been outlawed due to the fact that it must be assumed that cross-over resistances can develop and lead to the creation of a resistance pool. The samples examined are derived from poultry-breeding operations. In order to investigate the potential links described above, enterprises with different operating forms were chosen. These were conventional poultry farms, on the one hand, i.e. large-scale operations which potentially deployed Avoparcin (until its prohibition) as feed additive, and on the other hand ecological operations, i.e. small-scale farms raising livestock without medicinal additives to fodder. To collect data on as wide a spectrum as possible, samples were taken from the following areas: poultry house, slaughterhouse, and carcass. 223 samples were taken from the various areas, and 281 VRE strains were isolated. Initially, the species was identified in line with culture- morphological, biochemical and serological criteria. Once this was done, the glycopeptide sensitivity was tested by means of the microdilution method. The VanA gene of selected isolates (n=48) was proven by means of PCR. The selection criteria were origin, form of livestock holding, and resistance behaviour. A horizontal polyacrylamide-gel electrophoresis was conducted on the basis of these isolates. The gels were analyzed with a cluster analysis furnished by the software progam Gelcompar 3.1. 60.1% of all samples proved to be VRE positive. Of this total, 87.8% of the samples originated from conventional large-scale operations, and 30.5% from small-scale farms. In the case of the VRE isolates, these were exclusively E.faecium strains with high-level resistance behaviour. The VanA gene was detected in all selected isolates. The cluster analysis showed an agreement of more than 90% in the protein samples, and thus proves a high degree of relationship.