Generierung und Charakterisierung der Deletionsmutanten des G-Protein gekoppelten Rezeptors D2R von Drosophila melanogaster

Abstract

Dopamin ist als Neurotransmitter unmittelbar an Prozessen der Gedächtnisbildung beteiligt, jedoch ist bis heute wenig über die genaue Funktionsweise dieses biogenen Amines bekannt. Die im Gehirn exprimierten Dopamin-Rezeptoren können entweder aktivierend oder auch inhibierend auf Neurone wirken, je nach gekoppeltem G-Protein. In dieser Arbeit wurde die Rolle des Dopamin- Rezeptors D2R in Drosophila untersucht, welcher zu den D2-ähnlichen G-Proteingekoppelten Rezeptoren gehört und an ein inhibitorisches G-Protein koppelt.Um die Funktionsweise des D2R Rezeptors im Zusammenhang mit Gedächtnisprozessen und seinen Einfluss auf dynamisch verschiedene Gedächtnisphasen zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit Deletionsmutanten des Rezeptors generiert und mit Hilfe des gut etablierten olfaktorischen Konditionierungsparadigmas analysiert. Das aversive Lernparadigma macht sich die Duftkonditionierung zunutze, um dynamisch verschiedenen Gedächtnisphasen voneinander zu trennen. Dabei unterscheidet man die stabile Gedächtnisphase, welche bei einer Anästhesie nicht beeinträchtigt wird, und die labile Gedächtnisphase, welche dadurch ausgelöscht wird. So können entscheidende Fragen adressiert werden: Wie werden Gedächtnisse stabil konsolidiert oder lediglich labil implementiert und welche Rolle spielt das dopaminerge System, speziell der Rezeptor D2R, dabei? Die hier generierten Deletionsmutanten wiesen eine Beeinträchtigung im aversiven olfaktorischen Gedächtnis auf. Bei der Analyse der D2R-Mutanten konnte die Gedächtnisreduktion auf einen Ausfall der stabilen Gedächtnisphase zurückgeführt werden, während die labile intakt blieb. Dieser Phänotyp konnte ebenfalls durch einen RNAi-bedingten D2R- Knockdown hervorgerufen werden und wurde durch die panneurale Expression der D2R-cDNA Isoform 606 in der Deletionsmutante gerettet. Die etablierte D2R- spezifische RNAi-Linie und das hier vorgestellte D2R-cDNA-Konstrukt wurden genutzt, um D2R-relevanten Strukturen zu identifizieren, die für die Bildung des aversiven Gedächtnisses zuständig sind. Bei dieser Analyse zeigten sich Unterschiede in den identifizierten Strukturen. Der spezifische RNAi-Knockdown wies Pilzkörper-extrinsische Neuronen wie die anterior-paarig lateralen Neuronen, die lokalen Interneuronen des Antennallobus oder die dopaminergen Neuronen sowie neuronale Subpopulationen des Pilzkörpers, die alpha/beta- und gamma-Loben, als relevante Strukturen für die Gedächtnisbildungaus, wohingegen die Rettung mit den cDNA-Konstrukt nur die alpha/beta- und gamma-Loben identifizierte. Die Inkongruenz in den Strukturdaten könnten sich auf die verschiedenen Isoformen des D2R-Rezeptors zurückführen lassen. Diese sind bereits für den homologen D2R-Rezeptor der Säuger nachgewiesen und es wurde gezeigt, dass seine Isoformen in ihren Expressionorten und ihrer Funktion variieren können. Diese Arbeit liefert wertvolle Hinweise auf die Funktionalität des D2R-Rezeptors in den Prozessen des Lernens und Gedächtnisses und stellt mit der Etablierung der Mutante und dem cDNA- Konstrukt hilfreicheWerkzeuge für folgende Analysen zur Verfügung. Es konnte gezeigt werden, dass inhibitorische Dopaminsignale speziell zur Ausbildung der stabilen Gedächtnisphase benötigt werden, aber auch, dass die neuronale Integration dieser Signale hoch komplex ist. Die hier gezeigte Beteiligung des D2R-Rezeptors an der Konsolidierung des Gedächtnisses lässt auf eine Koregulierung mit den funktionell D1-ähnlichen, also aktivierenden Rezeptoren schließen und steht damit im Mittelpunkt von integrativen Mechanismen, welche dynamische Gedächtnisprozesse direkt steuern. Dabei kommen den einzelnen Isoformen unterschiedliche Wirkungsorte, Funktionen und Stellenwerte im Signalweg zu.

Dopamine is one of the most important neurotransmitter and mediates memory dependent transmission in mushroom body neurons, however very few is known about the function of the biogenic amine. The dopamine-receptor, expressed in the brain, could be act stimulatory or inhibitory on the neurons, depending on the kind of coupled G-protein. In this thesis, the role of the dopamine receptor D2R in Drosophila is aimed to be examined. It belongs to the D2-like-G-Potein coupled receptors and couples on an inhibitory G-Protein. Dopamine has been shown to be involved in memory dependent processes and depletion of dopaminergic signaling was shown to impair memory formation in Drosophila. To examine the function of D2R in learning and memory and its effect on the dynamic phases of memory a deletion mutant of the receptor D2R was generated in this study and analysed in olfactory learningparadigm. The aversive paradigm of olfactory memories was established years ago and it uses odor conditioning to separate and examine different dynamic phases of memory. Thereby it is possible to distinguish between a stable anesthesia resistant phase and a labile anesthesia sensitive phase, which is erased by anesthetic treatment of the fly. So we could adress pivotal questions: How could be memories stable consolidated or labile implemented and which role plays the dopaminergic system, especially D2R? The mutant indeed shows a reduction of the aversive olfactory memory. During the detailed analysis of the D2R- deletion mutant it could be shown, that the reduction of memory results from a loss of the stable phase while the labile phase is unaffected. This phenotype could be evoked by a D2R-spezific RNAi-knockdown and it could be rescued by panneural expressing the D2R-cDNA isoform 606. The established D2R-specific RNAi-line and the cDNA-construct introduced in this study were then used to identify the D2R-relevant structures, which are involved in the consolidation of stable memory. Here, an involvement of the alpha/beta- and gamma-lobes of the D2R receptor was shown, which could be localized by the RNAi-line and the cDNA-rescue construct. But also an incongruity in both tools had been shown. A RNAi-knockdown in mushroombody-extrinsic neurons, the anterior paired neurons, the local interneurons of the antennal lobe or in dopaminergic neurons lead to a loss of the stable memory phase, while its was not possible to rescue the phenotype in this structures. This difference could be due to the different isoforms of the D2R-receptor. It was shown that the homolog mammalian D2R- receptor has several isoforms, which vary in their expression and in their function. This leads to a changed affinity of the Gi-Proteins. The present study gives useful evidences of the function of the D2R-receptor in learning and memory and it established the deletion mutant and the cDNA-construct as helpful tools in following analyses. It could be shown, that inhibitory dopamine signals are specifically involved in the consolidation of stable memory in Drosophila and moreover, that the integration of these signals are highly complex. The results of this study highlight a possible coregulation between the activating D1-like and inhibitory D2-like-receptors. It seems that the quantitative and temporal regulation of the dopamine release and the receptor sensibility of ligands are crucial in the modulation of dopaminergic receptors, putting D2R at the heart of memory dependent signal integration that leads to the realization of different memory phases. Thereby the single isoforms have different areas of effect, functions and local values.