Neutralisation des porzinen endogenen Retrovirus (PERV) durch Antikörper gegen das transmembrane Hüllprotein p15E

Abstract

Die Xenotransplantation von porzinem Gewebe stellt eine Möglichkeit der Organtransplantation dar, die es ermöglichen soll, Menschen mit Organschäden zu retten bzw. deren Lebensbedingungen dauerhaft zu verbessern. Neben dem Risiko einer Infektion mit Bakterien, Pilzen oder anderen Parasiten stellt die Übertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERV) ein weiteres potentielles Risiko dar. Trotz der Möglichkeit, dass PERV in der Lage ist, in vitro humane Zellen zu infizieren, konnte bis heute in keiner klinischen Xenotransplantation mit porzinem Gewebe eine Übertragung von PERV festgestellt werden. Um dennoch die Möglichkeit einer Xenozoonose durch eine Übertragung mit PERV auszuschließen, wird in verschiedenen Richtungen geforscht. Darunter befindet sich auch die Induktion von neutralisierenden Antikörpern, um einen Impfstoff zur Verfügung zu stellen. Erneut konnten in dieser Arbeit neutralisierende Antikörper gegen das Transmembran- (TM-)protein p15E von PERV induziert werden. Eine affininitätschromatographische Aufreinigung zeigt erstmalig, dass nur die Antikörper neutralisieren, die gegen die membran- proximal region (MPER) gerichtet sind (Epitop: 589GWFEGWFNRSP599). Bindende Antikörper im N-terminalen Bereich (N-terminal heptad repeats, NHR) zeigten keine neutralisierende Wirkung gegenüber dem Virus. In einem weiteren Teil der Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass für die Induktion dieser MPER- spezifischen Neutralisationsantikörper die komplette Ektodomäne von p15E notwendig ist. Immunisierungen mit der C-terminalen Domäne des p15E oder auch mit einem längeren MPER-Peptid konnten keine neutralisierenden Antikörper induzieren. Im Gegensatz dazu wurden erstmalig neutralisierende Antikörper gegen die NHR-Domäne nach der Immunisierung mit einem N-terminalen Fragment von p15E gezeigt. Durch Einbeziehung der Epitop-Kartierungen aller Immunisierungen, die dieser Arbeit zugrunde liegen, binden diese erstmalig beschriebenen NHR-spezifischen Neutralisationsantikörper an das Epitop 506IVTEDLQALEKS517. Im Vergleich zu anderen Gammaretroviren (z.B. FeLV) und auch dem Lentivirus HIV-1 zeigte sich, dass die hier beschriebenen MPER- und NHR-spezifischen Neutralisationsantikörper ebenfalls bei anderen Retroviren zu finden sind. Da die Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen HIV-1 bisher nur bedingt gezeigt und in dieser Arbeit gleich mehrere gegen PERV beschrieben werden konnten, wurde ein Vergleich zwischen den transmembranen Hüllproteinen von PERV und HIV-1 durchgeführt. Darin wurden grundlegende Unterschiede in der Glykosylierung, der Länge der TM-Proteine sowie der Einfluss der Membranlipide auf die Induktion von MPER-spezifischen Antikörpern festgestellt. Gemeinsamkeiten und Unterschiede in wichtigen Strukturelementen wurden durch einen datenbasierenden Vergleich ergänzt. Allerdings zeigte sich bei diesen Vergleichen, dass beide TM-Proteine trotz Ähnlichkeiten an bindenden und neutralisierenden Antikörpern strukturell unterschiedlich aufgebaut sind. Neben der Induktion und Charakterisierung von Antikörpern, fand eine Charakterisierung von FPPR- und MPER-abgeleiteten Peptiden statt. Diese zeigte erstmalig, dass bestimmte Peptide durch Bindung am Virus eine PERV-Infektion von humanen Zellen beeinflussen. Insgesamt konnten in dieser Arbeit verschiedene PERV-neutralisierenden Antikörper induziert, aufgereinigt und charakterisiert werden. Der Vergleich zu HIV-1 neutralisierenden Antikörpern zeigt trotz ähnlicher Lokalisation derer Epitope auf ihren TM- Proteinen grundlegende strukturelle Unterschiede, so dass weitere Versuche zeigen müssen, ob die Übertragung der gewonnenen Ergebnisse bei PERV auch für eine Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen HIV-1 dienlich sein können.

Xenotransplantation could possibly help overcome the shortage of allografts needed for transplantation into patients suffering from organ failure. However, in addition to the risk of infection by bacteria, fungi or other pathogens, the transmission of porcine endogenous retroviruses (PERV) is of potential concern. Despite infection of human cell lines in vitro, none of the clinical xenotransplantations using porcine tissue has so far resulted in demonstrable transmission of PERV. However, various strategies to avoid a possible PERV xenozoonoses have been developed, one of which is the generation of an effective vaccine able to induce neutralising antibodies. Again neutralising antibodies against the p15E transmembrane (TM) protein of PERV could be induced. Here, for the first time, an affinity chromatography showed that only antibodies specific for the MPER (589GWFEGWFNRSP599) were shown to have neutralising activity. Furthermore, the data generated in another section of this work suggest that the entire ectodomain is important for the generation of neutralising antibodies specific for the MPER of PERV p15E. Immunisation with a C-terminal region of p15E or a longer MPER peptide failed to elicit neutralising antibodies. In contrary and for the first time, neutralising antibodies recognising the NHR of the PERV p15E TM protein were induced by immunising with the N-terminal subunit of p15E. Epitope mapping revealed a novel epitope in the NHR of PERV p15E (506IVTEDLQALEKS517). Corresponding neutralising antibody epitopes located in the NHR and the MPER had been described for other gammaretroviruses such as FeLV or the lentivirus HIV-1. Since the successful induction of strong neutralising antibody responses against the NHR or MPER of HIV-1 gp41 have not been described but in this work the corresponding antibodies specific for PERV were very easily generated, a comparison between the TM proteins was carried out. Although neutralising antibodies targeting the same region of the TM proteins gp41 and p15E were found, differences in glycosylation, protein length and the influence of lipids were found. In addition, a database comparison of the structures of PERV p15E and HIV-1 gp41 revealed additional dissimilarities that suggest profound differences during infection and therefore presentation in possible epitopes for antibody induction. In addition to the separation and characterisation of the purified antibodies for the first time peptides influencing a PERV infection were described. Overall several antibodies neutralising PERV could be induced, purified and characterised. Further experiments are needed to determine whether the induction of antibodies against PERV, as described here, will help with the induction of neutralising antibodies against HIV-1. The existence of neutralising antibodies binding to the NHR and MPER of the TM proteins of PERV and HIV-1 demonstrate that these regions may indeed be important targets for the neutralisation of various retroviruses.