Hepatitis D virus infection in humanized uPA/SCID mice: Characterization of virus-host interactions, persistence and impact of antiviral treatments

Abstract

About 15 million people worldwide are chronically infected with the hepatitis D virus (HDV). A chronic HDV infection shows the most severe clinical course of all hepatitis infections leading to liver cirrhosis in up to 70 % and to the development of hepatocellular carcinoma. Virus replication requires the generation of genomic and antigenomic HDV RNAs which are generated in a double rolling circle, while the envelope proteins of the hepatitis B virus (HBV) are needed for assembly and release of infectious virions. The limited availability of HDV infection models has hindered investigations of HDV pathogenesis and interactions between HDV and infected human hepatocytes. Currently an HDV specific therapy does not exist. Our group recently developed an HDV in vivo infection model using humanized uPA/SCID mice, which after transplantation of primary human hepatocytes into mice livers can stably be infected with HBV and HDV. Aims of this study were to characterize interactions of HDV and the innate immune system, to investigate the persistence and cell toxicity of an HDV mono-infection and to determine effects of different antiviral drugs on HDV productivity by establishing and using a novel assay to quantify genomic and antigenomic HDV RNA. By using the uPA/SCID mouse model it could be shown that the development of HDV viremia was accompanied by a clear induction of human-specific interferon stimulated genes (ISGs), which play an important role in the defense of viruses. While an HBV mono-infection only showed moderate inductions of classic ISGs (e.g. hMxA, hOAS1, hHLA-E, hIP10) in human hepatocytes, the expression of these ISGs was significantly stronger in an HBV/HDV co-infection. Also levels of human specific cytokines (hTGF-ß, hIFN-ß, hIFN-λ) were clearly increased in HBV/HDV co-infected mice, while their expression was lower or even below the lower limit of detection in HBV mono- and uninfected mice. This strong activation of the innate immune system might directly lead to liver damage and inflammation providing a rationale for the more severe course of HDV-associated liver disease. Another investigation within this thesis showed that an HDV mono- infection in humanized mice can persist for at least 6 weeks in the absence of HBV. Moreover persistent HDV particles could be rescued upon HBV super- infection and serially passaged into naïve human chimeric mice proofing the maintenance of HDV infectivity after a 6-weeks-phase of intracellular latency. These results explain observations in patients showing detectable intrahepatic HDV markers despite very low HBV activity or even after liver transplantation and emphasize the risk for these patients to develop a productive HBV/HDV infection after re-infection with HBV. Furthermore, a novel, quantitative RT- PCR assay was established, which specifically detects genomic and antigenomic HDV RNA in human chimeric mice livers and human liver patient biopsies. This assay now provides new possibilities to investigate the intrahepatic life cycle of HDV and the impact of different antivirals on HDV productivity in a more detailed way. E.g. a 4-week administration of pegylated interferon alpha not only reduced HDV viremia but also showed a decrease of both intrahepatic genomic and antigenomic HDV RNA levels. In contrast, a therapy with the nucleotide analogue entecavir efficiently suppressed HBV viremia but had no influence on HDV replication. Our interferon alpha studies also indicated that intrahepatic viral clearance could be achievable by suppressing HDV replication. At the same time these findings underline that due to its simplicity in structure HDV offers only very limited targets to eradicate the virus and that new therapeutic approaches are urgently needed.

Circa 15 Millionen Menschen sind weltweit chronisch mit dem Hepatitis-D-Virus (HDV) infiziert. Die chronische HDV-Infektion zeigt den schwersten klinischen Verlauf aller viralen Hepatitiden und führt in bis zu 70% der Fälle zu Leberzirrhose und zur Entstehung des hepatozellulären Karzinoms. Für die Replikation des Virus ist das Vorhandensein von genomischer und antigenomischer HDV RNA essentiell, während es für die Bildung und Sekretion von infektiösen Viruspartikeln die Hüllproteine von HBV benötigt. Da geeignete HDV-Infektionsmodelle fehlen, ist bisher wenig über die Pathogenese einer HDV- Infektion und Virus-Wirts-Wechselwirkungen in infizierten humanen Hepatozyten bekannt. Eine HDV-spezifische Therapie existiert derzeit nicht. Kürzlich haben wir ein HDV-Infektionsmodell entwickelt, bei dem uPA-SCID-Mäuse mit primären, humanen Hepatozyten repopuliert und mit HBV und HDV infiziert werden können. Die Ziele dieser Studie waren, Interaktionen zwischen HDV und dem angeborenen Immunsystem zu charakterisieren, die Persistenz und Zellschädigung des Virus in einer HDV-Monoinfektion zu untersuchen und mit Hilfe einer neuen Methode zur Quantifizierung genomischer und antigenomischer HDV, antivirale Effekte verschiedener Virustatika zu bestimmen. Unter Verwendung des uPA/SCID- Mausmodells konnte gezeigt werden, dass die Entwicklung der HDV-Virämie von einer klaren Induktion humaner Interferon-stimulierter Gene (ISGs), die eine wichtige Rolle bei der Abwehr Viren spielen, begleitet wurde. Während eine HBV-Monoinfektion im Vergleich mit uninfizierten Kontrollmäusen nur zu einem moderaten Anstieg der klassischen ISGs (z.B. hMxA, hOAS1, hHLA-E, hIP10) in humanen Hepatozyten führte, war die Induktion der ISGs während einer HBV/HDV- Koinfektion signifikant stärker ausgeprägt. Humane Zytokine (hTGF-ß, hIFN-ß, hIFN-λ) waren in einer HBV/HDV-Koinfektion ebenfalls deutlich induziert, während die Expression dieser Zytokine in HBV-monoinfizierten und uninfizierten Mäusen niedriger oder unterhalb der Messgrenze war. Diese ausgeprägte Aktivierung des angeborenen Immunsystems könnte direkt zu Leberschädigung und Leberentzündung führen und somit den schweren klinischen Verlauf einer HDV-Infektion erklären. Zusätzlich wurde beobachtet, dass eine HDV-Monoinfektion im uPA/SCID-Mausmodell intrahepatisch in der Abwesenheit von HBV für mindestens 6 Wochen persistieren kann und dass persistierende HDV- Partikel durch eine HBV-Superinfektion „gerettet“ werden können. Darüber hinaus bewies eine serielle Übertragung dieser HDV-Partikel in naive, human- chimäre Mäuse, dass deren Infektiosität bestehen bleibt. Diese Ergebnisse erklären Beobachtungen in Patienten, bei denen HDV auch bei sehr niedriger HBV-Replikation und sogar nach vollständiger Transplantation der Leber nachweisbar ist und unterstreichen das Risiko, dass nach erneuter Infektion mit HBV sofort eine aktive HBV/HDV-Koinfektion vorliegen kann. Weiterhin wurde eine neue, quantitative RT-PCR-Methode entwickelt, welche genomische und antigenomische HDV-RNA spezifisch in human chimären Mauslebern und Patientenbiopsien detektiert. Dieses Nachweisverfahren liefert neue Möglichkeiten, den Replikationszyklus von HDV und den Einfluss verschiedener Wirkstoffe detailliert zu untersuchen. So zeigte eine 4-wöchige Behandlung mit pegyliertem Interferon alpha nicht nur eine Erniedrigung der HDV-Virämie, sondern auch eine Reduktion der genomischen und antigenomischen RNA in humanen Hepatozyten, während eine Therapie mit Entecavir keinen Einfluss auf die Aktivität von HDV hatte. Am Beispiel von pegyliertem Interferon alpha ist zu sehen, dass durch erfolgreiche Hemmung der HDV-Replikation eine Viruselimination erreicht werden könnte. Gleichzeitig wird aber auch deutlich, dass HDV wegen seines einfachen Aufbaus sehr wenig Angriffspunkte für eine antivirale Therapie bietet und dringend neue Therapieansätze benötigt werden.