Maintenance of protein stability during formulation processing, storage and release is one of the main challenges for the effective parenteral delivery of protein drugs. Parenteral delivery with biodegradable injectable delivery systems based on poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) has been successfully applied for the controlled delivery of low-molecular-weight drugs and peptides. This was, however, less successful for protein drugs due to their higher structural and functional complexity. Since proteins stability is generally better in the solid-state, hot-melt extrusion (HME) as a solvent- free process was evaluated for processing of protein formulations. Yet, the high processing temperatures and pressures in HME can be potential stress factors for protein stability. The purpose of this study was to assess the feasibility of hot-melt extrusion for preparing implants based on protein/PLGA formulations with special emphasis on protein stability, burst release and release completeness. Model protein (lysozyme)-loaded PLGA implants were prepared with a screw extruder and a self-built syringe-die device as a rapid screening tool for HME formulation optimization. Lysozyme stability was determined using DSC, FTIR, HPLC and biological activity. Lysozyme was recovered from implants with full biological activity after HME. The effect of hydration upon contact with the release medium (as a potential protein instability factor) on the recovery was studied by extraction of lysozyme from the implants after 1 day release. In spite of full recovery, functional stability was affected by the HME process conditions and its impact on the resulting matrix properties (e.g., porosity). Under optimized conditions, complete active recovery of the protein was obtained. The release from all implants reached the 100% value in 60–80 days with nearly complete enzymatic activity of the last fraction of released lysozyme. Pure PLGA implants with up to 20% lysozyme loading could be formulated without initial burst. To obtain optimized formulations with high drug loading and low burst release the simultaneous effect of lysozyme and PEG loadings on the initial release was investigated. This screening revealed that the effect of PEG is dependent not only on its size and concentration but also on the concentration of the protein. At drug loadings exceeding 20%, incorporation of PEG 400 reduced the initial burst. Accordingly, a complete lysozyme recovery in active form with a burst-free and complete release from PLGA implants prepared by hot-melt extrusion was obtained. This is in contrast to several reported microparticulate lysozyme-PLGA systems and suggests the great potential of hot-melt extrusion for the preparation of protein-PLGA implants. The conformational stability during HME process was further examined with three less stable proteins; ovalbumin, cytochrome C and bovine serum albumin (BSA). DSC and FTIR revealed stability of the proteins and absence of non-covalent aggregation. This was especially interesting in the case of BSA which is a large and multi domain protein and highly prone to aggregation. MALDI-MS analysis revealed no detectable impurity formation after the process. BSA however, presented more challenges during release; high initial burst and incomplete release. The initial burst release was reduced by milling the protein prior to extrusion. Thus, PLGA implants with up to 25% BSA loading could be formulated without initial burst. The cumulative release was incomplete at 70% at loadings below the percolation threshold of the protein, while higher protein loadings increased the release to 97%. However, in all cases, an insoluble implant mass remained for over 6 months. Analysis of the residual matrices suggested a covalent linkage of BSA to PLGA oligomers via thioester bonds. Thus, covalent protein-PLGA adducts were responsible for the incomplete release from the delivery systems containing BSA. Increasing the porosity of the implants using ethanol-containing PLGA resulted in 100% release at 90 days with no insoluble implant mass remaining. Nevertheless, the presence of PLGA in the insoluble implant mass was surprising because in the absence of proteins PLGA degraded completely into water-soluble oligomers within 50-60 days. BSA reduced the PLGA degradation and erosion rate and most importantly the extent of the erosion. The total releasable protein fraction was correlated with the extent of PLGA mass-loss. Release study of implants prepared with pre-degraded PLGA exhibited similar BSA release pattern and completeness. This suggested that the degradation phase was not responsible for release incompleteness. Thus, to achieve complete release, enhancement of out-flux of degradation products, through an increase in porosity during the erosion phase, was intended. The porosity could be a result of higher diffusional release e.g. by reduction of matrix size or increasing BSA loading above its percolation threshold. Addition of pore-formers and/or plasticizers also increased both diffusional and erosional release. Consequently, no residual implants remained after complete release of BSA. Accordingly, enhancement of out-flux of PLGA degradation products, once formed, was proposed to increase protein-release completeness. In conclusion, hot-melt extrusion as a solvent-free process provided better stability of proteins and hence is a promising technique for processing of biodegradable implants for delivery of protein drugs.
Eine der größten Herausforderungen bei der Formulierung von Depotarzneiformen für Proteinwirkstoffe ist die Erhaltung der strukturellen und funktionellen Integrität der Wirkstoffe während der Herstellung, der Lagerung und der Freisetzung der Darreichungsform. Die Verabreichung von Arzneistoffen mit geringem Molekulargewicht und Peptiden mittels injizierbarer poly(glycolsäure- co-milchsäure)-basierter Depotformulierungen findet bereits breite Anwendung, welche den instabileren Proteinarzneistoffen bisher verwehrt blieb. Die ist unter anderem auf unvorteilhafte Einbettungsbedingungen zurückzuführen, welche die Proteinstruktur negativ beeinflussen können. Proteine weisen im festen Zustand eine generell höhere Stabilität gegenüber denaturierenden Einflüssen auf als in Lösung. Die Schmelzextrusion erlaubt die lösemittelfreie Einbettung von Proteinpartikeln in bioabbaubare Polymermatrices. Die dabei potenziell auftretenden hohen Drücke und Prozesstemperaturen sind allerdings mögliche Stressfaktoren für Proteine Mit dieser Arbeit sollte die Anwendbarkeit der Schmelzextrusion für die Herstellung von proteinbeladenen Implantaten auf Basis des bioabbaubaren Trägermaterials PLGA ermittelt werden. Schwerpunkte der Arbeit lagen dabei auf der Aufrechterhaltung der Proteinstabilität während der Herstellung, dem Erreichen einer vollständigen Proteinfreisetzung und dem Vermeiden einer hohen initialen Freisetzung. PLGA-Implantate mit Lysozym als Modellwirkstoff wurden mit einem 2-Schneckenextruder hergestellt. Ein selbstgebautes Instrument zur Extrusion kleiner Chargengrößen wurde zum Screening für HME Formulierungen verwendet. Die Lysozym-Stabiltät wurde mit DSC, FTIR, HPLC und über die biologische Aktivität ermittelt. Nach der Schmelzextrusion wurde Lysozym mit voller Aktivität wiedergewonnen. Um den Effekt der initialen Hydratation durch das Freisetzungsmedium auf die Proteinstabilität zu untersuchen, wurde Lysozym nach einem Tag Inkubation aus den Implantaten extrahiert. Trotzdem das Lysozym komplett wiedergewonnen werden konnte, wurde die Aktivität des Enzyms durch den HME-Prozess beziehungsweise dessen Einfluss auf die resultierende Matrixporosität verringert. Unter optimierten Bedingungen konnte der gesamte Proteinwirkstoff mit voller Aktivität aus den Implantaten wiedergewonnen werden. Die Freisetzung war aus allen Implantaten nach 60-100 Tagen vollständig wobei nahezu 100%ige enzymatische Aktivität nachgewiesen werden konnte. Reine Protein/PLGA Implantate konnten mit bis zu 20% Lysozym beladen werden ohne dabei eine hohe initiale Freisetzung (Burst) zu verursachen. Um Formulierungen mit hoher Arzneistoffbeladung und geringem Burst zu erhalten wurde der simultane Einfluss von PEG- und Lysozymbeladung der Implantate auf die initiale Freisetzung untersucht. Dieses Screening zeigte einen Effekt des PEG auf die Freisetzung der sowohl auf dessen eigener Konzentration, der Molekülgröße und auch auf der Konzentration des Proteins beruhte. Bei mehr als 20% Arzneistoffbeladung reduzierte PEG 400 den initialen Burst. Dadurch konnte eine Freisetzung von aktivem Lysozym ohne eine hohe initiale Freisetzung erreicht werden. Dies steht im Gegensatz zu vielen in der Literatur beschriebenen bioabbaubaren Mikropartikelsystemen. Die Schmelzextrusion erschien demnach zur Herstellung von Protein-PLGA-Implantaten geeignet. Es wurde weiterhin getestet, ob drei Proteine mit geringerer Stabilität während des HME-Prozesses intakt bleiben würden; Ovalbumin, Cytochrom C und Bovines Serumalbumin (BSA). DSC und FT-IR zeigten keine Zeichen für Denaturierungen oder die Präsenz von nicht-kovalenten Aggregaten, was auf die Erhaltung der nativen Konformation hindeutete. Besonders interessant war dies in Bezug auf BSA, da dies ein sehr großes, und viele Domänen beinhaltendes Protein ist, das besonders leicht aggregiert. Eine MALDI-MS Analyse zeigte keine nachweisbaren Verunreinigungen nach dem Prozess. Allerdings führte die Einbettung von BSA zu Schwierigkeiten bei der Freisetzung, welche durch einen hohen initialen Burst und eine unvollständige Freisetzung gekennzeichnet war. Der initiale Burst konnte vermindert werden indem die Partikelgröße des Proteins vor der Extrusion verringert wurde. Danach konnten PLGA-Implantate mit bis zu 25% BSA Beladung hergestellt werden ohne einen Burst zu zeigen. Die Freisetzung war mit maximal 70% unvollständig, wenn BSA die BSA-Beladung unter der Perkolationsgrenze gehalten wurde. Wurde allerdings eine Beladung oberhalb der Perkolationsgrenze eingesetzt, stieg die kumulative Freitsetzung auf bis zu 97%. In allen Fällen blieb unlösliche Implantatmasse über einen Zeitraum von 6 Monaten bestehen. Die Analyse des Rückstandes lies auf eine kovalente Bindung des BSA mit PLGA-Oligomeren durch Thioesterbindungen schließen. Die Bildung von kovalenten Bindungen während der Erosionsphase war daher für die unvollständige Freisetzung von BSA aus den PLGA-Implantaten verantwortlich. Eine Erhöhung der Porosität der Implantate durch Ethanolbeimengung zu der zu extrudierenden Protein-/Polymermasse, führte zu einer vollständigen BSA Freisetzung innerhalb von 90 Tagen, ohne dass sich ein unlöslicher Rückstand bildete. Überraschend war, dass PLGA in dem unlöslichen Rückstand nachgewiesen werden konnte, da PLGA in Abwesenheit von Proteinen innerhalb von 50-60 Tagen in wasserlösliche Oligomere abgebaut wird. BSA verlangsamte den PLGA-Abbau und die Erosionsrate leicht und verringerte insbesondere das Ausmaß der Erosion. Freisetzungsversuche mit Implantaten aus pre-degradiertem PLGA zeigten ähnliche Proteinfreisetzungsprofile und Ausmaße der Freisetzung im Vergleich zu unverändertem Polymer. Daraus konnte geschlossen werden, dass die Phase des rein chemischen Abbaus des PLGA nicht verantwortlich für die unvollständige Freisetzung des Proteins war. Als Konsequenz wurde eine Erhöhung des out-flux der Abbauprodukte angestrebt, um eine komplette Freisetzung zu erreichen. Dies sollte durch Erhöhung der Porosität des Implantats in der Erosionsphase erreicht werden. Um die Porosität zu erhöhen, gab es mehrere Möglichkeiten: erleichterte diffusionskontrollierte Freisetzung durch eine Verkleinerung der Matrix oder eine Erhöhung der BSA-Beladung über die Perkolationsgrenze hinaus. Auch ein Zusatz von porenformenden Stoffen und/ oder Weichmachern konnte die diffusions- sowie die erosionsbedingte Freisetzung erhöhen. Infolgedessen blieb nach vollständiger BSA-Freisetzung kein unlöslicher Rückstand zurück. Man kann daraus schließen, dass die Beschleunigung des Out-flux des löslichen PLGAs, die vollständigere Freisetzung von inkorporierten Proteinen zur Folge hat. Die Schmelzextrusion bietet folglich die Möglichkeit, Proteine ohne den Einsatz von Lösemitteln in bioabbaubare Polymermatrices einzubetten ohne die Stabilität negativ zu beeinflussen. Es ist deshalb eine sehr vielversprechende Technik um bioabbaubare Implantate für Proteinwirkstoffe herzustellen.
