Recruitment of regulatory cells by repetitive antigens

Abstract

The aim of this PhD work was the characterization of the principles of suppression and identification of the cellular mechanisms underlying the oligomer (PLP 139-151 16-mer) induced protection of EAE. The tolerogenic capacity of repeat antigens to control the development of EAE was carried out by using the SJL/J mouse EAE model. It was shown that the protection induced by oligomer T cell epitope PLP 139-151 was dependent of antigen specificity. Importantly, it is also demonstrated that PLP 139-151 16-mer was effective in the treatment of established EAE as its administration after appearance of the first clinical symptoms reversed ongoing EAE. Another important observation was that PLP 139-151 16-mer treatment markedly reduced leukocyte infiltration in the brain and spinal cord. Interestingly, suppression was actively transferred by cells from oligomer treated mice and this finding was consistent after transfer with total lymph node cells, CD4+CD25+ and B cells. Cytokine analysis of cells during the oligomer treatment showed increased production of IL-10 and suggested that suppression is not due to the failure of PLP-specific T cells to respond against the autoantigen, but resulted from the occurrence of suppressive cytokines after antigen specific stimulation. The importance of suppressive cytokines was demonstrated by the inhibition of the protective effect mediated by the epitope-oligomer after in vivo blocking of either IL-10 or TGF-b cytokines. Active suppression provoked by oligomerized peptides was partially mediated by CD4+CD25+ cells, which could be associated with the occurrence of immunosuppressive cytokines. The second part of the present thesis describes the use of parasite-derived repetitive sequences containing self epitopes as a reliable mean to induce tolerance. The fusion constructs that consist of a recombinant protein containing repetitive sequences from the Plasmodium falciparum S-Antigen linked to myelin T cell epitopes, were evaluated in the autoimmune EAE model for the ability of inducing tolerance. The efficacy of the treatment was evident when the antigen was given in form of a vaccination or as therapeutic intervention. The physical link between the T cell epitope and the repeat structure showed to be essential for the effectiveness of the treatment. This protective effect was also found to be antigen-specific and mediated by a process of active tolerance that includes the action of suppressive cytokines like IL-10, probably by the induction of suppressor T cells specific for the epitope linked to the repeat region. In summary, this work strongly supports an immunosuppressive role of repeat antigens to control the development of EAE with potential applications to rational vaccine design and treatment of autoimmune diseases.

Das Ziel der eingereichten Doktorarbeit ist die Untersuchung der zellulären Mechanismen, welche der Oligomer-induzierten Suppression von Autoimmunerkrankungen zu Grunde liegt. Die tolerogenen Eigenschaften dieser ‚repeat Antigene’ (PLP 139-151 16-mer) wurden hierfür am Beispiel der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) anhand eines SJL/J Maus- EAE-Modells näher charakterisiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Protektion durch das Oligomer antigenspezifisch ist. Zudem konnte gezeigt werden dass eine therapeutische Wirkung bei der Behandlung bestehender EAE möglich ist, da die Verabreichung des 16-mers nach Auftreten der ersten klinischen Symptome zu einer deutlichen Rückentwicklung der EAE führte. Als Grundlage dieses Effekts konnte dabei nachgewiesen werden, dass das 16-mer durch die Aktivierung von Suppressorzellen. Der Nachweis, dass die Suppression aktiv durch Suppressorzellen erfolgte gelang durch den apdoptiven Transfer entsprechender Lymphozytenpopulationen von oligomerbehandelten Mäusen, insbesondere von CD4+CD25+ Zellen. Die ex vivo Zytokinanalyse während der Behandlung ergab dabei eine erhöhten Produktion von IL-10. Die Ergebnisse deuten somit darauf hin, dass die Suppression nicht durch die direkte Einwirkung des Oligomers auf die autoreaktiven T Zellen ausgelöst wird, sondern indirekt auf der antigen-spezifische Induktion suppressiver Zytokine beruht. Die Bedeutung der suppressiven Zytokine wurde durch die Aufhebung des protektiven Effekts der Oligomere nach in vivo Blockade mittels IL-10R- oder TGF-b-spezifischer Antikörper bestätigt. Die aktive Suppression durch oligomerisierte Peptide konnte somit zumindest teilweise durch die Aktivierung von CD4+CD25+ Zellen erklärt werden, die mit dem Auftreten dieser immunsuppressiven Zytokine in Zusammenhang gebracht werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wurden ‚natürliche’ Epitopoligomere untersucht. Grundlage hierfür waren Fusionskonstrukte, welche auf repetitive Regionen von Parasitenproteinen beruhen. In dem untersuchten Fall wurden repetitive Sequenzen des S-Antigens des Malariaerregers Plasmodium falciparum an Myelin T Zellepitope gekoppelt und im EAE-Modell in Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Toleranzinduktion untersucht. In der Studie konnte dabei gezeigt werden, dass die repeat Region des Malariaerregers in der Tat tolerogene Eigenschaften besitzt, welche Wirkung bei Vakzinierungen oder therapeutischem Anwendungen bei der EAE zeigte. Vorläufige Studien ergaben dabei, das hierfür eine direkte physikalische Verbindung zwischen dem T Zell Epitop und der ‚repeat’ Struktur bestehen muss. Auch hier war der protektive Effekt antigenspezifisch und basierte auf ‚aktiver Toleranz’. Die Wirkung wurde durch suppressive Zytokinen wie z.B. IL-10 vermittelt, welches vermutlich von Suppressorzellen ausgeschüttet wird. Die Charakterisierung dieser Zellen und der genauen Wirkungsweise des S-Antigens würde somit neue Einsichten in parasitäre Toleranzmechanismen geben und könnte Grundlage neuer Werkzeuge für eine mögliche Kontrolle der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten sein.