Molekularbiologische Untersuchungen zum Pathogenesemechanismus der Skelettfehlbildungen SYNS1 und BDA2 im BMP-Signalweg

Abstract

Der BMP-Signalweg nimmt eine essentielle Rolle im Bereich der Musterbildung, der Organogenese, des Wachstums und der Homöostase des Skeletts ein. Dabei ist ein fein abgestimmtes Zusammenspiel von Expressionsort, -zeit und -menge sowie die Proteininteraktion der einzelnen Komponenten im BMP-Signalweg entscheidend, da bereits geringe Abweichungen während des komplexen Bildungsprozesses zu Fehlbildungen führen. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Pathogenese zweier Handfehlbildungen, BDA2 und SYNS1, die nach genetischen Analysen mit Mutationen betreffend der sezernierten Signalmoleküle BMP2 bzw. GDF5 assoziiert sind. Beide Proteine sind Mitglieder der TGFβ- Superfamilie und zeigen ein z.T. überlappendes Expressionsprofil während der embryonalen Extremitätenentwicklung in der Gelenksregion und im Perichondrium. Die dort verlaufenden Vorgänge sind besonders kritisch für die Etablierung eines korrekt ausgebildeten Gelenks und der Determinierung der Phalangen. Für die GDF5 Mutationen N445T und N445K, die mit SYNS1 assoziiert und in der überlappenden Proteininteraktionsoberfläche mit Nog und BMPR1B lokalisiert sind, konnte in vitro eine Insensitivität gegenüber dem BMP-Antagonisten Nog nachgewiesen werden. Dies resultiert in vitro als auch in vivo in einer verstärkten chondrogenen Aktivität, die zusätzlich die endogene negative Feedback-Regulation durch Nog umgeht. Die Position N445 ist unter den BMPs hochkonserviert, jedoch tragen BMP9 und BMP10 natürlicherweise dort ein Lysin und sind wie die GDF5 Mutanten Nog-insensitiv. Während ein einfacher Aminosäureaustausch von Lysin mit Arginin keine Nog-Sensitivität in Bmp9 induziert, konnte durch gezielte Mutagenese an zwei weiteren potentiellen Interaktionsstellen eine nahezu vollständige Nog-Sensitivität vermittelt werden. Zusätzlich zeigten zu GDF5 N445T analoge Mutationen in BMP2/4/7 keine Veränderung der Nog-Sensitivität. Daher kann dem Asparagin eine sehr wichtige Funktion bei der Interaktion mit Nog zugesprochen werden, jedoch ist diese im Gegensatz zu GDF5 bei weiteren Vertretern der BMPs weniger essentiell. Diese Erkenntnisse können, im Hinblick auf klinische Anwendungen im Bereich der regenerativen Medizin, beim Design von BMPs der 2. Generation (Superagonists) genutzt werden, um eine effektivere Therapie mit geringeren Proteinkonzentrationen zu ermöglichen. Für die Mikroduplikation 110 kb downstream von BMP2 konnte mit Hilfe eines transgenen Mausmodels eine extremitätenspezifische Reportergenaktivität ermittelt werden. Das resultierende Expressionspattern von LacZ überlappt mit endogener Bmp2 Expression, was auf die Anwesenheit eines Extremitäten-spezifischen Bmp2-Enhancer in der duplizierten Region hindeutet. Darüber hinaus konnte die Position der cis regulatorischen Sequenz auf ca. 1 kb eingegrenzt werden. Diese Ergebnisse haben einen zusätzlichen Pathogenesemechanismus der BDA2 aufgedeckt, der daraufhindeutet, dass durch die Duplikation eines Enhancer die Expression von BMP2 in der Extremität verändert und das Signalisierungsgleichgewicht zwischen BMPR1A und BMPR1B verschoben wird. Beide funktionellen Untersuchungen zur Genotyp-Phänotyp Korrelation untermauern die hochsensible Regulation des BMP-Signalwegs und bieten grundlegende Einblicke in die aufeinander abgestimmten Proteininteraktionen, die sich überschneidende Signalkaskaden während Entwicklungsprozesse ermöglichen.

BMP-signalling plays throughout the whole embryonic development and in the adult organism an essential role in pattern formation, organogenesis, growth and homeostasis of the skeleton. Especially during the limb development the fine-tuning of a dose dependent as well as spatially and temporally controlled expression pattern in combination with defined protein interactions between the members of the BMP-signalling pathway is crucial. Only small changes in these complex processes can result in skeletal abnormalities. This PhD thesis is devoted to clarify the pathogenesis of two skeletal malformations, BDA2 and SYNS1, which are associated with mutations concerning the secreted signalling molecules BMP2 and GDF5, respectively. Both proteins are members of the TGFβ- superfamily and show during limb development an overlapping expression pattern in the joint region as well as in the perichondrium. Patterning and differentiation processes at these locations are critical for establishing correct developed joints and phalanges. The GDF5 mutations N445T and N445K, which are associated with SYNS1, are situated in the overlapping receptor (BMPR1B) and antagonist (NOG) interface. Functional in vitro analysis of the GDF5 variants revealed a Nog-insensitivity and a change of signalling mode. Both effects result in vivo and in vitro in an enhanced protein activity supported by circumvented negative feedback loop of Nog. Interestingly, the residue N445 is highly conserved among the BMP-family except of BMP9 and BMP10 in which it is naturally substituted with lysine. Like the mutant GDF5, both BMPs are insensitive to Nog and show a high chondrogenic activity. While a simple exchange of arginine with lysine doesn’t induce Nog-sensitivity, successive introduction of two additional substitutions imparted high to total sensitivity on customized variants of Bmp9. Furthermore, homologous mutations to GDF5 N445T in BMP2/4/7 didn’t lead to Nog-insensitivity in these BMPs. Taken together, these results suggest a critical role of the asparagine in the BMP-NOG interaction face, which is less essential in BMPs than in GDF5. Out of this, these findings are useful for the design of second generation BMPs (superagonists), which can improve the effectivity of BMPs in low dosages for clinical applications in regenerative medicine. The microduplication 110 kb downstream of BMP2, which is associated with BDA2, contains evolutionary highly conserved sequences. By using a transgenic mouse model it was shown that this duplicated sequence is able to drive limb-specific reporter gene expression. The almost complete overlap of LacZ with endogenous Bmp2 expression indicates that a limb specific BMP2 enhancer is located within the duplicated sequence. Furthermore, the location of the cis-regulatory sequence was narrowed down to a ~1 kb fragment. These results reveal an additional pathogenesis mechanism of BDA2 which suggest an altered BMP2 expression through duplication of the enhancer resulting in a misbalanced BMPR1A and BMPR1B signaling in the developing limb. Both functional studies in this work concerning genotype-phenotype correlation emphasize the sensible regulation of the BMP pathway in the limb. Furthermore, they provide fundamental insights into the fine tuned protein interactions which make overlapping signalling cascades possible.