Crystal structures of N-acetylmannosamine kinase: Insights into activity, mutational modifications and inhibition

Abstract

Human ManNAc kinase (hMNK) is a functional domain of the bifunctional enzyme UDP-GlcNAc-2-epimerase/ManNAc-kinase (GNE). GNE is the key enzyme in the biosynthesis of sialic acid, the most abundant terminal sugar on glycan chains. The goal was to characterize the hMNK crystal structure, analyze important mutations of the MNK as well as create a basis to develop novel inhibitors of the hMNK and, as a consequence, of the sialic acid biosynthesis. In this work it has been shown that active hMNK can be expressed in a prokaryotic system. The purified hMNK was characterized to be a 70 kDa homodimer in solution with specific ManNAc Kinase activity. To facilitate the crystallization process, the expression using the 6-His-tag was optimized for large-scale purification. In a rapid two-step purification procedure using a Ni-NTA chromatography followed by FPLC gel filtration, more than 25 mg hMNK per liter E.coli culture could be obtained. Crystallization revealed, in addition to the previously described apo-structure, three novel structures: the MNK/ManNAc complex (1.65 Å), MNK/ManNAc/ADP (1.80 Å) and MNK/ManNAc 6 P/ADP (2.40 Å). The active center of the hMNK is highly coordinated in a network of polar and non-polar interactions. Upon ManNAc binding the hMNK exert a conformational change from an open conformation to a close conformation facilitating the binding and reaction with ATP. The amino acid D517 is found to be the catalytic center of the enzyme polarizing the O6 of the ManNAc and allowing the transfer of the gamma-phosphate of ATP. Two ions are found to be essential for this enzyme, namely Mg2+ for ATP coordination, and Zn2+ for ManNAc binding. Using novel information about the active center, hMNK mutations, which causes the autosomal recessive neuromuscular disease hereditary inclusion body myopathy (HIBM), was reassessed. Activity and specificity data were confirmed with purified hMNK HIBM mutants and correlated with the insights from the crystal structure. CD measurements revealed a similar change in secondary content for all the mutants. The strong propensity of hMNK to form aggregation at higher concentrations was seen as a potential underlying condition for HIBM and a hindrance to obtain workable protein crystals. As an attempt to find functional sialic acid biosynthesis inhibitors for cellular assays, potential hMNK inhibitors were tested in vitro and in newly established cellular assays. The applied GlcNAc derivates (GlcNProp, GlcNCyc, and GlcNPent) were no strong inhibitors of the hMNK in vitro and therefore has very limited effects in cells. Applying inhibitor modeling on the given hMNK crystal structure, a simple modification at C6 of ManNAc was postulated to generate a potent competitive inhibitor. 6-O-Ac-ManNAc was chemically synthesized and found be the best competitive hMNK inhibitor so far (Ki = 1.4 mM), and may be used as a lead structure for further inhibitor design.

Die humane ManNAc Kinase (hMNK) ist eine funktionelle Domäne des bifunktionellen Enzyms UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase (GNE). Die GNE ist das Schlüsselenzym der Biosynthese von Sialinsäure, dem häufigsten terminalen Zucker auf Glykanstrukturen. Das Ziel der Arbeit war es, die hMNK Kristallstruktur zu charakterisieren, wichtige Mutationen des Enzyms zu analysieren und die Grundlage für neuartige Inhibitoren der hMNK und Sialinsäurebiosynthese zu entwickeln. In der Arbeit wurde gezeigt, dass aktive hMNK in einem prokaryotischen System exprimiert werden kann. Die gereinigte hMNK ist in Lösung ein Homodimer von 70 kDa mit spezifischer Aktivität für ManNAc. Für Kristallisationsversuche wurde die Aufreinigung der hMNK mit dem 6 -His-Tag optimiert. In einem kurzen Reinigungsverfahren über zwei Schritte, Ni-NTA-Chromatographie gefolgt von FPLC-Gelfiltration, konnten mehr als 25 mg hMNK pro Liter E.Coli Kultur erhalten werden. Zusätzlich zu der beschriebenen Apo-Kristallstuktur der hMNK, konnten drei neue Strukturen: MNK/ManNAc (1,65 Å), MNK/ManNAc/ADP (1,80 Å) und MNK/ManNAc-6-P/ADP (2,40 Å) Komplex analysiert werden. Das aktive Zentrum der hMNK ist in einem dichten Netzwerk von polaren und unpolaren Wechselwirkungen koordiniert. Nach der Bindung von ManNAc verändert die hMNK ihre Konformation von einer offenen zu einer geschlossenen, was die Bindung und Reaktion mit ATP ermöglicht. Die Aminosäure D517 ist das katalytische Zentrum des Enzyms und polarisiert das O6-Atom von ManNAc für den Transfer des gamma-Phosphat von ATP. Zwei Ionen sind essentiell für das Enzym, nämlich Mg2+ für die ATP-Koordination und Zn2+ für ManNAc Bindung. Mit den neuen Strukturinformationen konnten hMNK Mutationen, die die autosomal rezessive neuromuskuläre Erbkrankheit, Hereditary Inclusion Body Myopathy (HIBM), verursachen, neu bewertet werden. Die Aktivität und Spezifität der gereinigten hMNK HIBM Mutanten wurden analysiert und korrelieren mit den Erkenntnissen aus der Kristallstruktur. CD-Messungen zeigten ähnliche Veränderung in der Sekundarstruktur für alle Mutanten. Die Neigung dieser Mutanten verstärkt zu aggregieren, besonders bei höheren Konzentrationen, wurde als ein Grund für HIBM angenommen und stellt ein Hindernis für Kristallisationsversuche dar. Um funktionale und in Zellen wirkende Inhibitoren für die Sialinsäure Biosynthese zu finden, wurden potentielle hMNK Inhibitoren in vitro und in etablierten Zell-Assays getestet. Die verwendeten GlcNAc-Derivate (GlcNProp, GlcNCyc und GlcNPent) sind jedoch keine starken Inhibitoren der hMNK in vitro und haben daher begrenzte Wirkung in Zellen. Durch Inhibitionsmodellierung der hMNK Kristallstruktur, wurde postuliert, dass eine einfache Modifikation am C6 von ManNAc ein potenter kompetitiver Inhibitor darstellen kann. 6-O-Ac-ManNAc wurde chemisch synthetisiert und zeigte sich als der bisher beste kompetitive hMNK-Inhibitor (Ki = 1,4 mm). Er kann als Leitstruktur für weitere Optimierungen verwendet werden.