Der Einfluss milder Hypothermie auf das Überleben von H9c2-Kardiomyoblasten nach CoCl2-induzierter HIF-Akkumulation

Abstract

Die vorliegende laborexperimentelle Promotionsarbeit wurde im Zeitraum vom 1.01.2010 bis zum 30.04.2011 im Forschungslabor der Abteilung für angeborene Herzfehler und Kinderkardiologie des Deutschen Herzzentrums unter der Leitung von Frau PD Dr. Katharina R.L. Schmitt durchgeführt. Die therapeutische Hypothermie zur Neuroprotektion ist inzwischen ein etablierter Be-standteil der Therapieleitlinien nach Asphyxie des reifen Neugeborenen und nach er- folgreicher Reanimation Erwachsener bei einem Herzkreislaufstillstand aufgrund ventri-kulärer Tachykardien23, 24. Die zellulären Mechanismen, die durch eine Hypoxie im zent-ralen Nervensystem beeinflusst werden, weisen Ähnlichkeiten mit den pathologischen Mechanismen im hypoxischen Myokard auf15. Hypoxische Episoden des Myokards tre-ten im Rahmen eines akuten Koronarsyndroms oder eines Herzkreislaufstillstandes auf. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss milder Hypothermie (34°C) auf das Myo-kard nach einer simulierten Hypoxie untersucht. Darüber hinaus erfolgte die Betrach-tung einer zusätzlichen Behandlung mit dem Katecholamin Isoprenalin und dem Sedati-vum Propofol auf das Zellüberleben nach Hypoxie. Eigens für diese Untersuchungen wurde ein in vitro-Modell von Kardiomyoblasten (H9c2-Zellen) entwickelt, welches eine Hypoxie des Myokards mit anschließender the-rapeutischer Hypothermie simuliert. Die H9c2-Zellen wurden für eine Stunde mit dem Hypoxie- Imitator CoCl2 [30µM] behandelt und anschließend für 24 Stunden bei 34°C inkubiert. Zusätzlich wurden nach der simulierten Hypoxie einige H9c2-Zellen mit Isop-renalin oder Propofol behandelt. Es erfolgte eine Analyse des Schadens, der Zellvitalität und intrazellulärer Signalwege zu mehreren Zeitpunkten bis zu 48 Stunden nach der simulierten Hypoxie. H9c2-Zellen weisen unter Hypothermie nach einer simulierten Hypoxie eine höhere Zellvitalität auf als mit normothermer Behandlung. Die zusätzliche Gabe von Propofol oder Isoprenalin zeigten in den untersuchten Dosen und Temperaturen keinen Effekt auf das Zellüberleben. Die selektive Untersuchung von Proteinen belegte eine Regula-tion der intrinsischen Apoptose durch Hypothermie: Das Verhältnis der antagonistischen Proteine Bax (pro-apoptotisch) und Bcl-2 (anti-apoptotisch) wurde durch die Behandlung mit Hypothermie zugunsten von Bcl-2 verändert. Die Aktivität der Caspase 3, eines Schlüsselproteins der Apoptose, wurde durch die therapeutische Hypothermie reduziert. Der beobachtete Effekt auf die Caspase 3-Aktivität war in der frühen Phase nach simu-lierter Hypoxie stärker und nahm im Verlauf ab. Unter Hypothermie wurden Spaltpro-dukte eines zytoskelettalen Caspase-Substrates (Cytokeratin 18) zeitlich verzögert und in geringerem Ausmaß beobachtet. Die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit zeigen, dass die frühzeitige Applikation milder Hypothermie (34°C) den Myokardschaden nach Hypoxie vermindern kann. Die kardi-oprotektive Wirkung ist auf eine Regulation der Apoptose in der Frühphase nach der Hypoxie zurückzuführen. Isoprenalin und Propofol zeigen im vorliegenden in vitro-Modell keinen Einfluss auf das Zellüberleben.

Therapeutic hypothermia is an established method for treatment of newborn infants after perinatal asphyxia and resuscitation of adults from cardiac arrest following ventricular fibrillation. The pathogenic cellular mechanisms of hypoxic insult to the central nervous system and myocardium are similar. Myocardial hypoxia occurs in the context of acute coronary syndrome or cardiac arrest. This study analyzes the effect of mild hypothermia (34°C) on myocardium after a hypoxic episode in vitro. Furthermore, the effect of isoprenaline or propofol in conjunction with mild hypothermia following hypoxia was investigated. An ad hoc in vitro model consisting of the H9c2 rat cardiomyoblast cell line was devel-oped to investigate myocardial hypoxia and subsequent application of hypothermia. H9c2 cells were incubated with hypoxic mimetic agent CoCl2 [30 mM] at 37 °C for an hour followed by cooling to 34 °C for an additional 24 hours. Furthermore, a second sample group is treated with isoprenaline or propofol following induced hypoxia. Cell damage, viability, and intracellular signals in comparison to normothermic controls are investigated. Following simulated hypoxia, a significantly higher cell viability was shown in hypother-mic groups as compared to normothermic controls. Treatment with isoprenaline or propofol showed no significant additional cardioprotective effect at the dosage analyzed. In fact, the addition of either drug further minimized the difference in viability between normothermic and hypothermic groups. In a study of the intrinsic apoptotic pathway, several proteins were verified to be regu-lated by hypothermia. The proportion of anti-apoptotic Bcl-2 to pro-apoptotic Bax changes in favor of increasing Bcl-2 in the hypothermic treated H9c2 cells. In addition, the level of activity for Caspase 3, a key protein for apoptosis, is reduced under hypo- thermia. This effect was observed to a greater extent at the earlier time points following hypoxia and decreased throughout the duration of the experiment. Finally, fission prod-ucts of the cytoskeletal caspase substrate, keratine 18, were seen with a delay and to a lesser extent in hypothermia treated cells. The results of this study demonstrate the cardioprotective effect of mild hypothermia (34°C), if applied immediately following hypoxic insult. This influence is mainly due to a reduction in apoptotic activity at the early stages of cell damage. The additional applica-tion of Isoprenaline and Propofol showed no effect on the cell viability. Whether the observed effect can be used in a clinical setting in order to reduce the overall mortality after resuscitation has to be investigated in further studies.