IDENTIFICATION OF ERYTHROPOIETIN ISOFORMS AND EVALUATION OF THEIR BIOLOGICAL IMPORTANCE

Abstract

Erythropoietin (EPO) is a hematopoietic cytokine that functions as the main regulator of erythropoiesis. In the last years EPO was found to have multiple functions outside of the bone marrow. EPO acts as an antiapoptotic and tissue- protective cytokine in multiple in vitro and in vivo studies. Subcloning and sequencing of human and murine EPO-PCR products led to the discovery of alternative EPO transcripts in this study. Transcripts containing precise deletions between direct repeats were revealed to result from template- switching of the RT-polymerase, whereas the finding of three alternatively spliced transcripts was reproducible in an alternative RT-PCR approach. Two human splice forms, namely hS3 missing exon 3 and hS4 missing the first half of exon 4, were isolated from human brain and kidney polyA+ RNA. From murine tissue RNA I isolated one murine EPO splice variant missing exon 4 (mS). Evidence for the existence of the EPO splice variants on a protein level was provided by immunoprecipitation of two proteins from tissue-extracts of CoCl2-treated mice, corresponding in size to murine EPO and mS. The human and murine erythropoietin isoforms were expressed as recombinant proteins in mammalian cell lines and analyzed in cell culture assays for erythropoietic and cytoprotective characteristics. In an in vitro erythropoiesis assay, based on murine bone marrow, all EPO variants turned out to be non-hematopoietic. Neuroprotective potential was tested in an in vitro model of cerebral ischemia consisting of oxygen and glucose deprivation (OGD) in primary cortical cultures of the rat. In this experimental setup all EPO variants were shown to induce tolerance against OGD. Signaling pathways in primary cortical neurons were exemplarily studied for hEPO and hS3 and revealed to be identical. Protein sequence comparison of the murine and human EPO isoforms led to the hypothesis that the A-helix would be sufficient for mediating neuroprotective actions without stimulation of erythropoiesis. This hypothesis was confirmed in this study. Even smaller fragments of the A-helix were shown to be effective leading thereby to the discovery of neuroprotective non- hematopoietic EPO A-helix derived peptides. The observation, that the EPO variants did not stimulate erythropoiesis but provided cytoprotective functions equivalent to EPO, suggested the existence of an alternative cytoprotection-mediating EPO receptor. Furthermore the EPO variants were shown in a variety of experimental setups not to bind the classical homodimeric (EPOR)2. In this study I provide evidence, that the EPO splice variants mediate neuroprotection through an alternative binding site involving the LIF receptor family. The second part is focused on putative effects of the EPO variants on adult stem cells. I could show the EPO variants to provide general survival effects on murine hematopoietic, neural and mesenchymal stem cells. Interestingly the hS3 was found to induce additional differentiation effects in neural stem and progenitor cells resulting in enhanced formation of astrocytes.

Erythropoietin (EPO) ist ein hämatopoietisches Zytokin, welches als Wachstumsfaktor für die Bildung roter Blutkörperchen von Bedeutung ist. In den letzten Jahren wurden Hinweise darauf gefunden, dass EPO auch Funktionen außerhalb des Knochenmarks ausübt. In vitro und in vivo Studien zeigten, dass EPO als Gewebe-schützendes und anti-apoptotisches Molekül wirkt. Durch Subklonierung und Sequenzierung von PCR-Produkten konnten in der vorliegenden Arbeit alternativ gespleißte Transkripte des humanen und murinen EPO-Gens nachgewiesen werden. Mehrere Transkripte enthielten Deletionen zwischen zwei kurzen identischen Sequenzen, sogenannten „direct repeats“. Dieses Deletionsmuster ist als Folge von „template-switching“ der RT-Polymerase bekannt. Drei klassische Spleißvarianten von EPO konnten dahingegen auch in alternativen RT-PCR Verfahren verifiziert werden. In humaner Nieren- und Hirn- polyA+ RNA wurden zwei humane EPO-Spleißvarianten entdeckt, in welchen Exon 3 (hS3) bzw. die erste Hälfte von Exon 4 (hS4) fehlten. In muriner cDNA wurde eine Spleißvariante gefunden, die eine Deletion von Exon 4 trug (mS). Indizien für die in vivo Existenz der murinen Spleißvariante auf Proteinebene wurden in Immunpräzipitationsexperimenten gewonnen. Aus Gewebeextrakten CoCl2-behandelter Mäuse konnten mittels spezifischer Antikörper für EPO zwei Proteine isoliert werden, die in ihren Molekulargewichten mit dem murinen EPO und der Spleißvariante mS übereinstimmten. Die humanen und murinen Isoformen von EPO wurden als rekombinante Proteine in Säugetier-Zelllinien exprimiert. Hämatopoietische und zytoprotektive Eigenschaften der Proteine wurden in Zellkulturexperimenten untersucht. In einem klonalen Wachstumsexperiment, basierend auf hämatopoietischen Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks, konnte gezeigt werden, dass keine der EPO Varianten die Bildung erythroider Kolonien stimuliert. Untersuchungen zum neuroprotektiven Potential der rekombinanten Proteine wurden in einem neuronalen Zellkulturmodell des kombinierten Sauerstoff-Glukose-Entzugs (OGD) durchgeführt. In diesem in vitro Modell der zerebralen Ischämie vermittelten alle EPO Varianten einen Schutz vor dem induzierten apoptotischen Zelltod. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente zur Signaltransduktion von hEPO und hS3 in primären Neuronen weisen auf identische intrazelluläre Mechanismen hin. Ein Vergleich der primären Proteinsequenzen der humanen und murinen EPO Varianten führte zu der Annahme, dass die A-helix entscheidend für die neuroprotektive Eigenschaft von EPO ist. Diese Hypothese konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Auch für kleinere Fragmente der A-helix konnte Neuroprotektion nachgewiesen werden, was zur Entdeckung nicht-hämatopoietischer neuroprotektiver EPO Peptide führte. Die Tatsache, dass die EPO-Varianten zytoprotektive jedoch keine hämatopoietischen Effekte vermitteln, wies auf einen alternativen Gewebe-schützenden EPO Rezeptor hin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Varianten nicht an den klassischen homodimerischen EPO-Rezeptor (EPOR)2 binden. Erste Ergebnisse deuten auf eine Beteiligung des LIF Rezeptors an der hS3-vermittelten Neuroprotektion hin. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit Wirkungen der EPO Varianten auf adulte Stammzellen. Es konnte gezeigt werden, dass EPO-Varianten das Überleben muriner hämatopoietischer, neuronaler und mesenchymaler Stammzellen fördern. Darüber hinausgehend vermittelt die hS3-Variante auch die Differenzierung neuronaler Stammzellen und Vorläuferzellen in einen astrozytären Phänotyp.