dc.contributor.author
Liu, Yong
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:06:23Z
dc.date.available
2017-12-06T11:36:28.089Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5738
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9937
dc.description.abstract
Introduction: CTC (Circulating tumor cell) can provide molecular
characterization of metastatic tumor cells and dynamically monitor therapy
strategy, but CTC may lose epithelial biomarker expression during metastasis.
The aim of our research is to increase the CTC detection rate by optimizing
CTC staining and recovery and specifically evaluate GCC (guanylyl cyclase C)
as a marker for circulating colorectal cancer cells. Methods: GCC protein was
detected and compared in paired rectal cancer tissues and normal mucosal
tissues from 80 cases by immunohistochemistry (data from China). Circulating
GCCmRNA was detected from 160 stage I-III colorectal cancer patients by qRT-
PCR, and analyzed with long -term survival (data from China). Several negative
CTC enrichment-based protocols were used and optimized to increase the
recovery rate of colorectal cancer cells. Several GCC antibodies were
evaluated for staining of colorectal cancer cell lines and leukocytes by flow
cytometry. Results: GCC protein was significantly over-expressed in rectal
cancer tissues compared to paired normal mucosal tissues. High GCCmRNA level
in peripheral blood was significantly associated with tumor emboli in vessels,
lymph node metastases, mesenteric root lymph node metastases and poor
survival. Together with tumor embolus in vessel and mesenteric root lymph node
metastasis, GCCmRNA was a hazard factor for predicting poor patients’ survival
by multivariate COX regression analysis. For optimizing CTC enrichment, the
recovery of spiked CTC could be improved by an average of 16.23% by
introducing a second round of depletion of the already negatively depleted
CD45+ fraction. High GCC staining in T84, moderate in LS174T and low in other
colon cancer cell lines were observed. Additionally, all the colon cancer cell
lines showed a high percentage of cells expressing GCC (it ranged from 53.12%
to 97.01%) at their first passage from frozen tube. Unfortunately, however,
non-specific surface and intracellular binding of two conjugated GCC
antibodies was observed (average rate 50.29% and 53.67%) when compared to
isotype controls (average rate 10.74%), which restricts further application of
GCC antibodies for CTC detection from patients. Conclusions: Additional
depletion of CD45+ depleted fraction can increase the recovery rate of CTCs.
Nonspecific binding of three GCC antibodies in leukocytes restricts their
application in clinical practice. GCC antibodies without nonspecific binding
site should be designed for CTC detection of colorectal cancer in the future.
de
dc.description.abstract
Einleitung: Die Analyse CTC (zirkulierender Tumorzellen) wird entwickelt, um
metastatische Tumoren molekular zu charakterisieren und Therapiestrategien
dynamisch zu überwachen. Eine wesentliche Limitation ist aber die instabile
Expression epithelialer Marker auf CTC. Das Ziel unserer Forschung ist es, die
Wiederfindungsrate von CTC durch die Verwendung neuer gewebespezifischer
Merker zu optimieren. Methoden: Das GCC-Protein (konjugierte Guanylylcyclase
C) wurde als interessanter Marker definiert. Zunächst wurde die Expression von
GCC beim Rektumkarzinom an gepaarten Proben von Tumorgewebe und normaler
Schleimhaut an 80 Fällen durch Immunhistochemie verglichen (Daten aus China).
Blutproben von 160 Patienten im Stadium I-III-Darmkrebs in China wurden durch
qRT-PCR auf GCCmRNA untersucht und die Daten mit der Überlebenszeit
verglichen. Mehrere Protokolle zur CTC-Anreicherung wurden entwickelt um die
Wiederfindungsrate von Darmkrebszellen zu optimieren. GCC-Antikörper wurden
hierfür mit Farbmarkern konjugiert bzw. konjugierte käuflich erworben und auf
ihre Eignung zur Isolation von kolorektalen Tumorzellen in der
Durchflusszytometrie getestet. Ergebnisse: GCC-Protein war in Rektumkarzinom
im Vergleich zur normalen Schleimhaut stark überexprimiert. Hohe GCCmRNA-
Spiegel im peripheren Blut waren signifikant mit Tumor-Embolien in Gefässen,
Lymphknotenmetastasen, Lymphknotenmetastasen in der Mesenterialwurzel und
schlechterem Überleben assoziiert. In der multivariaten Analyse waren Tumor
Emboli, und Lymphknotenmetastasen in der Mesenterialwurzel und GCCmRNA
unabhängige Risikofaktoren für das Überleben, mit oder ohne TNM-Schichtung.
Als Optimierungsschritt für die CTC-Anreicherung wurde zusätzlich durch
Recycling der CD45-positiven, CTC-abgereicherten Fraktion nochmals
durchschnittlich 16% der eingesetzten Tumorzellen wiedergewonnen. Die GCC-
Färbung war in T84 Zellen hoch, moderat in LS174T und niedrig in anderen
Darmkrebszellen. Allerdings zeigten alle Colon-Krebszelllinien einen hohen
Prozentsatz an GCC (von 53,12% bis 97,01%) in ihrer ersten Kulturpassage, die
bei weiterer Kultivierung abnahm. Problematisch war eine nicht-spezifische
Färbung von Leukozyten bei Oberflächen- und intrazellulärer Färbung mit den
beiden selbst konjugierten GCC-Antikörpern (mittlere Rate 50,29% und 53,67%)
und auch mit dem nachträglich kommerziell erworbenen direkt konjugiertem
Antikörper, was die Anwendung von GCC-Antikörpern für die CTC-Detektion bei
Patienten beschränkt. Schlussfolgerungen: Nach der CD45-Depletion kann die
Wiederfindungsrate von CTCs durch zusätzliches Recycling von CTC aus der CD45+
Fraktion erhöht werden. Aufgrund der unspezifischen Färbung von Leukozyten
können die GCC-Antikörper für die CTC-Erkennung trotz der guten
Färbeeigenschaften bei Darmkrebszelllinien nicht verwendet werden, spezifische
konjugierte GCC-Antikörper ohne Kreuzreaktion mit Leukozyten wären notwendig.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
colorectal neoplasm
dc.subject
circulating tumor cell
dc.subject
guanylyl cyclase C
dc.subject
flow cytometry
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Targeted guanylyl cyclase C for optimization of circulating colorectal cancer
cells enrichment and isolation
dc.contributor.contact
liuyong@zjcc.org.cn
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2017-12-08
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000105535-7
dc.title.translated
Guanylylcyclase C als Marker zur Optimierung der Anreicherung und Isolation
von zirkulierenden kolorektalen Krebszellen
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000105535
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000022344
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access