Oligonucleotide fingerprinting (OFP) is a high-throughput alternative to tag sequencing methods to determine the spectrum and abundance of genes in genomic DNA or cDNA libraries. This method currently relies on the sequential hybridisations of at least 200 short (8-12 mer), radioactively labeled DNA oligonucleotides to arrayed dsDNAs. After image analysis, a sequence fingerprint is generated for each clone based on the hybridisation signals. Then according to the fingerprint similarity, the clones from the same gene can be grouped together using clustering algorithms. The main problems of the classic OFP method include high oligoprobe number and the use of radioactivity. To resolve these problems, here we have exploited the high affinity and good mismatch discrimination of oligoprobes modified with locked nucleic acid (LNA). In our method, short (hexamer or heptamer) LNA-modified oligoprobes are labelled with fluorescent dyes (e.g. Cy5). Hybridisation results are recorded with a CCD-camera developed for this purpose. The sensitivity of the fluorescence detection permits the convenient use of homogenous liquid assay as well as nylon membrane support. Thus hybridisation data quality is improved, and the process accelerated, simplified, and less expensive.
Oligonukleotid Fingerprinting (OFP) ist eine attraktive Alternative zu TAG- Sequenzierungsmethoden zur Bestimmung vorhandener Gene in genomischer DNA und cDNA Bibliotheken im Hochdurchsatz. Diese Methode basiert im Moment auf der sequentiellen Hybridisierung von mindestens 200 kurzen (8 12 Nukleotide) radioaktiv markierten Oligonukleotiden, um dsDNA aufzureihen. Basierend auf den Hybridisierungssignalen wird nach einer Bildanalyse für jeden Klon ein Sequenz-Fingerprint erstellt. Mit Hilfe von Cluster-Algorithmen können dann Fingerprints mit großer Ähnlichkeit zusammengefaßt werden. Ein Problem der aktuellen Methodik stellt die hohe Anzahl benötigter Oligonukleotide und die verwendete Radioaktivität dar. In dieser Arbeit wurden die hohe Affinität und zugleich gute Diskrimination von sogenannten Locked Nucleic Acid (LNA) untersucht, um die Anzahl der benötigten Oligos und deren Länge zu reduzieren. Zusätzlich wurden zur Vermeidung von Radioaktivität kurze (Hexamere oder Heptamere), modifizierte LNA s benutzt, die einen fluoreszierenden Farbstoff trugen (z.B. Cy5). Die Ergebnisse wurden mit einer für diesen Zweck entwickelten CCD-Kamera aufgenommen. Die Empfindlichkeit der Fluoreszenzbestimmung diese Methode sorgt dafür, dass sowohl in Lösung befindliche Assays als auch solche auf Nylon-Membranen verwendet werden können. Dadurch ist die Datenqualität verbessert, der Prozeß ist einfacher, schneller und damit auch billiger.
