Transkriptionelle Regulation des lymphogenen VEGF - Rezeptor 3 - Gens in Endothelzellen

Abstract

Hintergrund: VEGFR-3 besitzt als Bindungsstelle für die lymphangiogenen Faktoren VEGF-C und VEGF-D eine entscheidende Bedeutung für physiologische Prozesse der Lymphangiogenese während der Embryogenese. Die Bedeutung von VEGFR-3 für die Regulation der Lymphangiogenese wurde durch die Assoziation mit pathogenetischen Schritten der Tumorgenese und Metastasierung verdeutlicht, in denen eine vermehrte Expression in einer Vielzahl solider Tumoren nachgewiesen wurde. Während für andere Vertreter der VEGF-/VEGFR- Familie bereits Transkriptionsfaktoren und entscheidende regulative Elemente der transkriptionellen Regulation beschrieben worden sind, fehlen für das vegfr-3 Gen trotz seiner großen Bedeutung für lymphangiogenetische Prozesse wesentliche Kenntnisse über die molekularen, strukturellen und funktionellen Mechanismen. Methode: Durch molekularbiologischen Techniken wurde der vegfr-3 Promotor kloniert, um mittels 5’-Promotoranalyse unter Generierung von Reportergenkonstrukten essentielle Promotorelemente und strukturelle Charakteristika zu ermitteln. Transiente Transfektionen in Endothelzellen zeigten ein Minimalpromotorelement, das als Sonde für EMSA-Studien zur Identifikation nukleärer Transkriptionsfaktoren diente. Durch Synthetisierung von Mutanten zum Einsatz als DNA-Sonde wurde die funktionelle Rolle der identifizierten Transkriptionsfaktoren bestimmt sowie im heterologen Promotorsystem ohne mammalischer Transkriptionsfaktoren untersucht. Anschließend wurden die identifizierten strukturellen und funktionellen, molekularen Charakteristika des vegfr-3 Promotors im Vergleich zu den Vertretern der VEGF-/VEGFR-Familie interpretiert. Ergebnisse: Erstmals wurden mit Sp1 und Sp3 aus der Familie der Zinkfinger-bindenen Proteine essentielle Transkriptionsfaktoren für die Regulation des vegfr-3 Gens beschrieben, die an (5')-101 TCCCGGGCCCGCCTCCGGCCCCCGCCCCGCCCCGCC -66(3') binden. Damit wurde für vegfr-3 ein essentielles, regulatives GC-reiches Element im proximalen Promotorbereich identifiziert. Für beide Transkriptionsfaktoren wurde eine Transaktivatorfunktion mit Bindung an GC-Boxen gezeigt. Es konnte eine bevorzugte Bindung von Sp1 an den vegfr-3 Promotor demonstriert werden. Für vegfr-3 konnten konservierte GC-reiche Elemente mit ähnlichem Nukleotidmuster im Vergleich zu anderen Vertretern der VEGF-/VEGFR-Familien nachgewiesen werden. Diskussion: Mit der Analyse der transkriptionellen Regulation des vegfr-3 Promotors wurde ein weiteres Gen aus der VEGF-/VEGFR-Familie identifiziert, an dessen Regulation Sp1 und Sp3 beteiligt sind. Beide Transkriptionsfaktoren wurden bereits für die Regulation wachstumsterminierender Gen-Promotoren und Angiogenese-Gene beschrieben. Neben VEGFR-3 wurden auch Sp1 und Sp3 in der Tumorgenese verschiedener Tumorentitäten nachgewiesen. Sp1 wurde als unabhängiger, molekularer Marker für das Magenkarzinom und das kolorektale Karzinom beschrieben, in denen auch die erhöhte Expression von VEGFR-3 identifiziert wurde. Schlussfolgerung: In dieser Arbeit konnten basale transkriptionelle Regulationsmechanismen der Genexpression von vegfr-3 gezeigt werden. Die Ergebnisse sind bedeutungsvoll für ein besseres Verständnis der molekularen Regulation von vegfr-3 und sollen für weiterführende Untersuchungen die Grundlage für eine umfassendere physiologische und pathobiologische Einordnung bieten.

Enhanced expression of VEGFR-3 has recently been associated with clinical outcome and lymphatic metastasis of solid malignancies including gastric cancer. Despite the clinical importance and its generally accepted role in lymphatic development and metastases, the molecular mechanisms controlling vegfr-3 gene expression are largely unknown. After initial cloning of 2 kb of the proximal human vegfr-3 promoter region, we identified a minimal regulatory promoter element at -101/-66 as essential for vegfr-3 transcription. Combination of EMSA studies, site-directed promoter mutagenesis and overexpression experiments in SL-2 cells identified binding and activation of the zinc finger proteins Sp1 and Sp3 as crucial mechanisms for vegfr-3 transcription. This study for the first time describes the molecular mechanisms controlling human vegfr-3 gene transcription and identifies Sp- factors as the core mediators of vegfr-3 transcription. By demonstrating the molecular regulation of vegfr-3 transcription the study may contribute to a development of new intervention strategies influencing lymphangiogenesis and lymphatic metastases.