Das Ziel dieser Arbeit war es, die Entstehung paraxialen Mesoderms im Mausembryo in einem in vitro System zu modellieren. Mit Hilfe des in vitro Modells sollten transkriptionelle Veränderungen in den embryonalen Stammzellen im Verlauf der Differenzierung ausgelesen und analysiert werden. Es wurde ein Differenzierungsprotokoll in einer adhärenten Zellkultur etabliert, um aus embryonalen Stammzellen der Maus mit hoher Effizienz paraxiales Mesoderm zu generieren. Zur Beobachtung des Differenzierungsverlaufs und zur Analyse der transkriptionellen Veränderungen in den Zellen während verschiedener Phasen der Differenzierung wurde eine Reporterlinie mit zwei unterschiedlich fluoreszierenden Markergenen generiert. Diese Stammzelllinie zeigte den Eintritt der Zellen in den Primitivstreifen über einen T-Reporter sowie die Bildung von Mesoderm über einen Msgn1-Reporter an. Die Reporterzellen wurden zur Differenzierung in serumfreiem Medium gehalten und mit BMP4 und DKK1 oder WNT3a und Noggin stimuliert. Mit Hilfe der Reportergene konnten die Zellen des Primitivstreifens und des Mesoderms mit einem Durchflusszytometer während der in vitro Differenzierung isoliert und ihre Transkriptionvergleichend untersucht werden. Obwohl die fluoreszierenden Reporter in beiden Ansätzen aktiviert wurden, konnte gezeigt werden, dass nur bei der Stimulation mit WNT3a und Noggin Zellen mit transkriptionellen Eigenschaften des anterioren Primitivstreifens und paraxialen Mesoderms entstehen. Unter den differenziell exprimierten Genen konnten Faktoren identifiziert werden, die möglicherweise eine bislang unbekannte Rolle bei der Entstehung von paraxialem Mesoderm spielen.
The aim of this study was to model the differentiation of paraxial mesoderm in the mouse embryo using an in vitro system. A protocol was established that allowed the generation of paraxial mesoderm from murine embryonic stem cells with high efficiency. Using this in vitro differentiation technique, transcriptional changes in murine embryonic stem cells were monitored and analyzed in the course of their differentiation. To track the differentiation, a dual reporter cell line was generated, harboring distinguishable fluorescent reporter genes for T (Brachyury) and Msgn1 activity. These reporter genes showed the transition to the primitive streak stage and adoption of mesoderm fate, respectively. The differentiation of the reporter cells was induced in serum-free medium containing two combinations of recombinant proteins, either WNT3a and Noggin or BMP4 and DKK1. Using the two reporter genes, it was possible to isolate cells of each stage of differentiation and do comparative transcriptional analysis. It was found that both reporters were activated under both conditions. Transcriptional analysis revealed that only after stimulation with WNT3a and Noggin the cells showed expressional characteristics of paraxial mesoderm and anterior streak derivatives. Genes which were only upregulated in the Msgn1-reporter expressing population after stimulation with WNT3a and Noggin were identified and represent genes with a potential role in the development of paraxial mesoderm.
