CCR4-abhängige Migration regulatorischer T-Zellen bei Morbus Crohn

Abstract

Morbus Crohn ist eine chronisch entzündliche Darmerkrankung. Wechselwirkungen von genetischen Veranlagungen und immunologischen Veränderungen als auch Umweltfaktoren und eine veränderte intestinale Mikrobiota stehen im Zentrum der Ätiopathogenese. Immunologisch ist nach heutigem Kenntnisstand eine fehlerhafte Balance zwischen Immunantwort und Immuntoleranz gegenüber dem Mikrobiom charakterisierend. Regulatorische T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle in der Erhaltung des immunologischen Gleichgewichtes. Wenn deren Anzahl reduziert oder deren Funktion im Verhältnis zu den Effektorzellen eingeschränkt ist, resultiert daraus eine gestörte Immunantwort. Bei Morbus Crohn konnten bisher keine funktionellen Defekte regulatorischer T-Zellen nachgewiesen werden. Es wird deshalb davon ausgegangen, dass die überschießende Immunantwort am Ort der Entzündung durch eine verminderte Anzahl regulatorischer T-Zellen bedingt ist. Dabei ist ebenso unklar, ob dies aus einer gestörten peripheren Induktion oder gestörten Migration von regulatorischen T-Zellen resultiert. Regulatorische T-Zellen verfügen über Oberflächenstrukturen, die unter anderem die Wanderung in sekundär lymphatische Organe wie in die Darmlymphknoten und zum Ort der Entzündung ermöglichen. Zwei dieser „Homing-Moleküle“ sind der Chemokinrezeptor CCR4 und das Zell-Adhäsionsmolekül CD62L. Das Chemokin TARC als Ligand für den CCR4-Rezeptor bei funktionellen Untersuchungen wurde ausgewählt, weil es in entzündlichem Gewebe bei Morbus Crohn vermehrt exprimiert wird. CD62L ist vor allem für das Rezirkulieren regulatorischer T-Zellen im Blut und in Lymphknoten wichtig und ist ein Marker für deren supprimierende Aktivität. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Unterschiede in der Expression und Funktionalität von „Homing-Molekülen“ zwischen T-Zell-Populationen von Morbus Crohn-Patienten und gesunden Probanden bestehen. Die Oberflächenstrukturen von T-Zellen wurden mit der Durchflusszytometrie analysiert, wobei Zellen des peripheren Blutes sowie Lymphknotenzellen des Darmes untersucht wurden. Zellen aus unterschiedlichen Geweben sollten eine Aussage über den Aktivitätsstatus und die Rekrutierung regulatorischer T-Zellen liefern. Weiterhin wurde die spezifische Wanderung regulatorischer T-Zellen anhand eines CCR4-abhängigen Migrationsassays untersucht. In eine Well-Platte wurde dafür eine permeable Membran eingesetzt, durch die die Zellen aktiv wandern konnten. Das Chemokin CCL 17/TARC diente dabei als „Lockstoff“ für die spezifische Migration durch die Membran. Die Anzahl der gewanderten Zellen wurde dann durchflusszytometrisch ermittelt. Die Vergleichsuntersuchungen ergaben, dass im peripheren Blut die Dichte von CCR4 auf regulatorischen T-Zellen bei Morbus Crohn im Vergleich zu den Gesunden signifikant vermindert ist. Dies stützt die Annahme, dass regulatorische T-Zellen bei Morbus Crohn eine verminderte Expression von Chemokinrezeptoren aufweisen und deshalb nicht zum Ort der Entzündung gelangen können. Die Migration der CD4+FOXP3+ T-Zellen war bei Patienten mit Morbus Crohn im Vergleich zu Gesunden vermindert. Weiter konnte eine Verminderung des Anteils der CD62L+ regulatorischen T-Zellen bei Morbus Crohn-Patienten Im Vergleich zu Gesunden nachgewiesen werden. Auch dies kann als wichtiger Hinweis auf eine fehlerhafte Migration regulatorischer T-Zellen bei Morbus Crohn gewertet werden. Sowohl im Lymphknoten als auch im peripheren Blut konnten bei den Gesunden als auch bei den an Morbus Crohn Erkrankten deutlich mehr CCR4+ regulatorische T-Zellen vom CD45RO+-Typ gefunden werden als vom naiven Typ. Die Oberflächeneigenschaften dieser regulatorischen T-Zellen entsprechen dem Phänotyp von Gedächtniszellen, Zellen mit bereits stattgehabtem Antigenkontakt. Interessanterweise konnten bei den Untersuchungen verschiedene FOXP3-Populationen anhand des Expressionsniveaus für FOXP3 identifiziert werden. Es sind sowohl die FOXP3low Zellen als auch die FOXP3high Zellen bei Morbus Crohn-Patienten im peripheren Blut gegenüber denen bei Gesunden vermindert. Die vorgestellten Daten zeigen eine reduzierte CCR4-abhängige Migration regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit Morbus Crohn. Die aus der verminderten Migration resultierende geringere Anzahl supprimierender T-Zellen im Verhältnis zu den Effektorzellen im Entzündungsgebiet bei Morbus Crohn trägt möglicherweise zu einer chronischen Entzündungsreaktion bei dieser Erkrankung bei.

Morbus Crohn is an inflammatory bowel disease (IBD). The disease is a result of genetic disposition, immunologic disorders and environmental influences as much as differences of the intestinal mucosa. On the immunologic site, there is an imbalance between immunologic response and tolerance against the microbiom. Regulatory t cells play an essential role sustaining the immunologic balance. For IBD, current data show that Treg proportion in peripheral blood is decreased in active disease. So far, no functional defects of Treg from IBD patients have been described since they maintain their normal function of cell-contact-dependent, cytokine-independent suppressive capacity, even against pathogenic T-effector cells derived from the inflamed mucosa. In contrast to peripheral Treg, their frequency is comparatively low in inflamed IBD mucosa compared to diverticulitis. Currently, it is not clear whether this phenomenon is caused by a disturbed peripheral induction or migration of Treg. Here, we demonstrate that Treg from CD patients show a functional defect caused by an impaired CCR4-dependent migration capacity and mediated by a decreased expression of CCR4. This may explain decreased Treg frequencies in inflamed IBD mucosa. It is probable that CCR4 is not the only molecule that is involved in the inappropriate migration of Treg in CD. It has been described in CD that fewer CD4+ memory cells express CD62L. This receptor decelerates lymphocytes by engaging ligands expressed on high endothelial venules. CD62L is therefore required for recirculation and compartmentalization of CD4+ cells between blood and lymph nodes. Although we found an accumulation of Treg in mesenteric lymph nodes, there is also a lower percentage of CD62L+ peripheral Treg, some of them also express CCR4. This may point to a more extensively disturbed migration of Treg in CD. Based on these results, it becomes conceivable to design therapeutic strategies which manipulate the intestinal recruitment of Treg and thus suppress the pathologically increased immune reaction in IBD.