The aggregation of soluble proteins to protease-resistant fibrils is a hallmark of neurodegenerative diseases. This phenomenon has been observed in proteins that under certain conditions undergo a structural transition from an unfolded or partially helical state to a β-sheet structure. Factors such as a solution’s pH, protein concentration, presence of metal ions, and temperature have been identified as triggers of protein aggregation. In addition, post translational modifications, e.g. phosphorylation, have been implicated in aberrant protein fibrillization over the last two decades. However, current studies on phosphorylation patterns in natural aggregating systems suffer from major drawbacks; for instance, rapid dephosphorylation of phosphoproteins in vivo renders the identification of key phosphorylated residues difficult, whereas in vitro enzymatic phosphorylations generate heterogeneous mixtures of proteins phosphorylated at various sites and to different extent. This work presents several examples of a successful application of synthetic phosphopeptides as tools for studying amyloid formation. Using such analytical techniques as circular dichroism spectrscopy, Thioflavine T-induced fluorescence, and Transmission Electron Microscopy various aspects of peptide and protein fibrillization were investigated. For example, the influence of site-specific and multiple phosphorylation on the amyloid formation process was examined utilizing an amyloid forming coiled coil peptide model. Structural analysis of phosphorylated peptides revealed that regardless of the quantity and position of modification, the formation of β sheet structure was completely abolished. Furthermore, all phosphorylated peptides completely lost their amyloid forming potential. Subsequently, with the objective to understand and monitor structure switching as well as fibril formation and morphology under conditions that approximate physiological environment, a dephosphorylating enzyme was applied as a natural aggregation trigger. In addition, synthetic phosphopeptides were applied to investigate metal-induced conformational transitions. Coordination of magnesium and manganese ions to phosphate groups induced vigorous structural changes, resulting in stable α helices and helical fibers, respectively. Finally, in addition to the aforementioned investigations of coiled coil model systems, also phosphorylation in a natural aggregating system was probed. Here, a combination of synthetic and recombinant approaches (expressed protein ligation) was used to generate homogenous preparations of site-specifically phosphorylated microtubule-assisted tau protein – a major component of neurofibrillary tangles, the primary marker of Alzheimer’s disease.
Die Aggregation löslicher Proteine zu proteolytisch stabilen Fibrillen ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Krankheiten. Dieses Phänomen wurde bei Proteinen beobachtet, die unter bestimmten Bedingungen strukturelle Übergänge von einer ungefalteten oder teilweise helikalen Konformation zu einer β-Faltblattstruktur durchlaufen. Umgebungsfaktoren wie der pH-Wert, die Anwesenheit von Metallionen, die Temperatur sowie die Proteinkonzentration selbst wurden als Auslöser der Proteinaggregation identifiziert. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde aber auch die Rolle posttranslationaler Modifikationen wie z.B. der Phosphorylierung in diesem Zusammenhang diskutiert. Die Untersuchung der Rolle der Phosphorylierung in natürlichen Systemen sieht sich jedoch mit einigen schwerwiegenden Problemen konfrontiert. Der schnelle Abbau von Phosphoproteinen in vivo macht es beispielsweise schwierig, phosphorylierte Reste genau zu identifizieren. Auf der anderen Seite führt die enzymatische Phosphorylierung in vitro oftmals zu heterogenen Produkten mit unterschiedlichem Phosphorylierungsgrad. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden einige erfolgreiche Anwendungen synthetischer Phosphopeptide als Modelle zum Studium der Proteinaggregation vorgestellt. Verschiedene Aspekte der Fibrillenbildung wurden mit Hilfe unterschiedlicher analytischer Methoden wie CD-Spektroskopie, Thioflavin-T induzierter Fluoreszenz sowie Transmissionselektronenspektroskopie untersucht. Hierbei wurde z.B. der Einfluss ortsspezifischer und multipler Phosphorylierung auf das Aggregationsverhalten eines Amyloid bildenden Coiled-Coil-Modellpeptids untersucht. Die strukturellen Analysen haben gezeigt, dass die Umfaltung zum β-Faltblatt unabhängig von der Anzahl und Position modifizierter Reste durch die Phosphorylierung vollkommen unterdrückt wird. Sämtliche phosphorylierte Peptide zeigten darüber hinaus keine Neigung zur Bildung vom Amyloiden. Um die Prozesse der Umfaltung und Fibrillenbildung, sowie deren Morphologien unter physiologischen Bedingungen besser verstehen zu können, wurde im Weiteren ein Enzym, das Phosphatgruppen abspaltet, als natürlicher Auslöser der Aggregation eingesetzt. Weiterhin wurden durch Metallionen induzierte konformationelle Übergänge an synthetischen Phosphopeptiden untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass die Koordination von Magnesium- und Manganionen an Phosphate ausgeprägte strukturelle Veränderungen, wie zum Beispiel die Bildung stabiler α-Helizes bzw. helikaler Fibrillen zur Folge haben. Zusätzlich zu diesen Untersuchungen wurde auch die Phosphorylierung eines natürlichen aggregierenden Systems untersucht. Dabei kam eine Kombination aus rekombinanter Proteinexpression und Peptidsynthese zum Einsatz, um homogene Präparate ortsspezifisch phosphorylierten Tau-Proteins, einer wichtigen Komponente von Neurofibrillen und dem primären Kennzeichen der Alzheimerschen Krankheit, darzustellen.
