Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Röntgenkristallstruktur der 5'-Nucleotidase (5'-NT) aus Escherichia coli mit der Methode des multiplen isomorphen Ersatzes und der multiplen anomalen Dispersion bis zu einer maximalen Auflösung von 1.7 Å gelöst werden. Die 5'-NT besteht aus zwei Domänen, welche über eine lange a -Helix verbunden sind. Das aktive Zentrum befindet sich in einer Spalte zwischen den beiden Domänen. Während die größere N-terminale Domäne, welche die Metalliganden enthält, eine starke Ähnlichkeit zu anderen bereits aufgeklärten Strukturen von Metallophosphoesterasen mit Dimetallzentrum aufweist, wie den Ser/Thr-Proteinphosphatasen, dem Calcineurin und den violetten sauren Phosphatasen, so erscheint die Tertiärstruktur der C-terminalen Domäne einzigartig zu sein. Eine Überlagerung der Liganden des aktiven Zentrums der 5'-NT, der violetten Phosphatase, der Proteinphosphatase 1 und der Proteinphosphatase 2B zeigt, daß die konservierten Metalliganden und das katalytische His-117 sehr gut mit identischen Konformationen überlagern.
Strukturen von insgesamt vier unterschiedlichen Kristallformen wurden analysiert, in denen die 5'-NT unterschiedliche Konformationen besitzt in Bezug auf die relativen Orien-tierungen der zwei Domänen. Die C-terminale Domäne ist in den Kristallformen III und IV um bis zu 96° relativ zu ihrer Orientierung in den Kristallformen I und II rotiert. Die Bindung von Substrat und Substrat-analogen Verbindungen an beide Enzymformen unterstellt die Vermutung, daß es sich bei den Kristallformen I und II um eine inaktive Form des Enzyms handelt, da das Substrat etwa 20 Å entfernt vom aktiven Zentrum bindet. Dagegen enthalten die Kristalle III und IV das Enzym in seiner aktiven Konformation. Die 5'-Nucleotidase wurde in der aktiven Konformation als Kokristallkomplex mit Adenosin und Phosphat (Kristallform III) sowie mit dem Inhibitor a ,b -Methylen-ADP (Kristallform IV) analysiert. In dieser Konformation binden Adenosin und Phosphat bzw. der Inhibitor am aktiven Zentrum.
Der vorgeschlagene Reaktionsmechanismus geht von einem Michaelis-Komplex aus, bei dem ein Wassermolekül die Rolle des am Phosphor angreifenden Nucleophils übernimmt. Der Substratbindungsmodus stützt sich im wesentlichen auf die strukturell beobachtete Anbindung von a ,b -Methylen-ADP an die 5'-NT. Die Umsetzung des Substrats verläuft über einen Übergangszustand nach einem inline-Mechanismus, der mit einer Inversion der Konfiguration am Phosphoratom verbunden ist. Somit muß der Produktkomplex einen anderen Bindungsmodus der Phosphatgruppe aufweisen als der Substratkomplex.
Die in den 5'-NT Strukturen beobachtete relative Rotation der N- und C-terminalen Domänen um 96° beschreibt eine erstmalig beobachtete Art der Domänenbewegung, wobei die kleinere C-terminale Domäne annähernd um ihren Massenschwerpunkt rotiert. Dabei bewegen sich die Reste des Domäneninterfaces hauptsächlich in Richtung des Interfaces. Diese Art der Domänenrotation unterscheidet sich wesentlich von der klassischen gelenkartigen Domänenschließbewegung, bei der sich die Substrat- oder Liganden- Bindungsspalte zwischen den beiden Domänen öffnet, wobei sich die Aminosäuren in der Spalte vor allem senkrecht zum Domäneninterface bewegen.
Da ein Primärsequenzvergleich mit anderen bakteriellen und tierischen 5'-NTs viele konservierte Regionen aufweist, die sich besonders in der N-terminalen Domäne in Bereichen der Liganden des aktiven Zentrums befinden, handelt es sich bei der 5'-NT aus E. coli wahrscheinlich um ein gutes Modell für die noch unaufgeklärten Strukturen anderer 5'-NTs. Die anderen 5'-NTs sind sehr wahrscheinlich ebenfalls aus zwei Domänen aufgebaut, die vielleicht auch eine Domänenrotation zur Kontrolle des Katalysemechanismus besitzen.
The crystal structure of 5'-nucleotidase (5'-NT) from E. coli, also known as UDP-sugar hydrolase, has been determined using four different crystal forms at 1.7 Å, 2.2 Å, 2.1 Å and 1.9 Å resolution. 5'-NT is monomeric and consists of two domains connected by an a -helix. The major difference between the four crystal structures is a hinge-bending domain movement of 96° which divides the protein structures in an open and closed conformation. Two endogenous zinc ions in the active site of the open conformations are coordinated in a trigonal-bipyramidal way by protein ligands and a metal-bridging water molecule or a (bi)carbonate ion. In the closed conformation two manganese ions in the active site are coordinated octahedral by protein ligands, phosphate or inhibitor molecule, a metal-bridging and a monodentate binding water molecule. The active site shows structural homology to related enzymes of the superfamily of b a b a b -metallophosphoesterases, including Ser/Thr protein phosphatases and purple acid phosphatases, but differs in the metal coordination sphere of the site 1 metal ion and other active site residues. The most prominent difference is the presence of a second domain in 5'-NT that forms part of the active site, located in a cleft between the two domains.
In the open conformation, substrate ATP is bound to the C-terminal domain at a distance of about 20 Å from the catalytic center. In the closed conformation, cocrystal structures of 5'-NT in complex with the products adenosine and phosphate and complexed with the substrate analogue inhibitor a ,b -methylene- ADP have been determined in order to study the reaction mechanism.
E. coli 5'-NT exhibits a unique 96° domain motion in which the smaller C-terminal domain rotates approximately around its center such that the residues at the domain interface move predominantly in the direction of the interface. This movement differs from a classical hinge-bending closure motion which involves an opening of the substrate or ligand binding cleft between two domains such that the residues of the cleft move predominantly perpendicular to the domain interface. Structures of the open and closed forms with substrates and inhibitors show that the substrate moves by 20 Å with the large domain rotation into the catalytic site. Nine independent conformers have been analysed in the four crystal forms. The domain motions derived from a comparison of these conformations show that all conformational changes can be described as domain rotations around axes that are roughly located in one plane. This plane includes the domain centers and the hinge. Two residues, Lys-355 and Gly-356, form the core of the hinge region and undergo a large change of the main-chain torsion angles.
