dc.contributor.author
Vallée, Moritz Robert Johannes
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:49:35Z
dc.date.available
2013-11-26T09:21:18.644Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5467
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9666
dc.description.abstract
In this thesis, phosphonites were investigated as an alternative
functionalization tool in Staudinger reactions. Firstly, different aryl
phosphonites bearing a model functional mOEG group at the aromatic ring were
synthesised with various alkoxy substituents including alkyl and small mOEG
groups. To protect the phosphonites against oxidation or hydrolysis during
purification and storage, a borane protection group was introduced, which can
be cleaved off with DABCO prior to the Staudinger reaction. Subsequently, the
mOEG-functionalized phosphonites were probed in the Staudinger reaction with
fully unprotected azido peptides in buffer systems with up to 92% conversion
of the azido peptide. As the most important result, the first successful
functionalization of the protein calmodulin bearing a p-azidophenylalanine at
position 2, via the Staudinger-phosphonite reaction was accomplished. In order
to develop a general synthesis pathway for functionalized phosphonites and to
ease the introduction of various functional modules such as fluorophores,
carbohydrates etc., a second generation of phosphonites was established. The
aromatic system was replaced by an alkyne substituent, which allows the
introduction of the functional module by CuAAC. The CuAAC does not interfere
with any other functional groups of both, the functional module and the
protected phosphonite. It is most important to acknowledge that after CuAAC
reaction and purification copper-free borane-protected tetrazole phosphonites
were obtained. It can be concluded that this new reaction protocol stands out
for its high flexibility with regard to the introduction of the functional
module and its short reaction sequence. Afterwards, the second generation of
phosphonites was investigated in-depth with respect to different functional
modules and their behaviour in Staudinger reactions in organic solvents. It
could be demonstrated that a wide variety of functional modules could be
attached to the alkyne phosphonite and even very challenging phosphonites such
as unprotected carbohydrate phosphonites were accessible. These phosphonites
were successfully utilised in Staudinger reactions with different azides. The
synthesized carbohydrate tetrazole phosphonite was converted with azido
polyglycerol to obtain a carbohydrate functionalized polymer, which showed
excellent binding in a SPR-based peanut agglutinin–carbohydrate binding assay.
During the Staudinger-phosphonite reaction with aryl azides, the formation of
the corresponding aryl amines was observed as a side product. Their formation
could be explained by unselective hydrolysis of the phosphonimidate leading to
the amino peptide and a phosphonate. This hypothesis was proven by the
hydrolysis of the corresponding phosphonimidate with 18O-labelled water. This
result provides additional insight into the mechanism of the Staudinger
reaction. After successful application of the Staudinger-phosphonite reaction
in organic solvents, the reaction was transferred to aqueous buffer systems.
To achieve a good solubility in water and an increased stability against
hydrolysis, phosphonites with oxy-bound mOEG2 as well as p mOEG-m-nitrobenzyl
substituents at the oxygen were synthesized. The new triazole phosphonites
showed a three- to five-fold enhancement in stability against hydrolysis
compared to the first generation of phosphonites. To study the conversion of
azido peptides at low concentrations, either fluorophore-tagged peptides were
used and the resulting product mixture was analysed by HPLC-fluorescence, or
conversions were determined by quantitative mass spectrometry with deuterated
peptide as internal standard. These studies revealed that the best conversion
of azido peptides was achieved in 100 mM tris / HCl buffer at a pH of 8.2, at
an azido peptide concentration of 50 μM and with 250 to 500 equivalents of
phosphonite in dependence on the oxy-bound substituents. Finally, the previous
findings on the Staudinger-phosphonite reaction with tetrazole phosphonites
were applied for the biotinylation of Rasa1-N. The biotinylated protein was
immobilized onto Streptavidine-coated magnetic beads and phosphorylation
binding studies were performed.
de
dc.description.abstract
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Phosphonite als Alternative zu den bereits
untersuchten Phosphiten hergestellt und auf ihre Anwendbarkeit in der
Staudinger Reaktion untersucht. Zunächst wurden Arylphosphonite mit
unterschiedlichen Alkoxysubstituenten synthetisiert. Um eine Oxidation oder
Hydrolyse der Phosphonite während der Synthese zu verhindern, wurde eine
Boran-Schutzgruppe eingeführt, welche im letzten Schritt unter Verwendung von
DABCO vor der nachfolgenden Staudinger Reaktion wieder abgespalten werden
konnte. Die Anwendung der ungeschützten mOEG-funktionalisierten Phosphonite
wurde nachfolgend in der Staudinger Reaktion mit ungeschützten Azidopeptiden
in verschiedenen Puffersystemen getestet, wobei ein Umsatz der Azidopeptide
von bis zu 92% beobachtet werden konnte. Anschließend konnte durch
erfolgreiche Umsetzung des Proteins Calmodulin, in welches an Position 2
anstelle von Tyrosin p-Azidophenylalanin eingebaut wurde, die erste
erfolgreiche Funktionalisierung eines Proteins mittels der Staudinger-
Phosphonite Reaktion gezeigt werden. Um einen einfacheren Zugang zu den
funktionalisierten Phosphoniten zu ermöglichen, wurde eine modulare Synthese
für eine zweite Generation von Phosphoniten entwickelt. Diese modulare
Synthese ermöglicht es, auch komplexe funktionalen Einheiten, wie Fluorophore,
PEG-Gruppen und Kohlenhydrate ohne komplizierte Schutzgruppenmanipulationen
einzuführen. Dazu wurde das aromatische System gegen ein Alkin ausgetauscht,
welches die Einführung einer funktionalen Einheit über CuAAC ermöglicht. Die
CuAAC zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass keine Kreuzreaktion mit
anderen funktionellen Gruppen, hier der funktionalen Einheit und des
Phosphonits, auftreten. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass nach der CuAAC
Reaktion das erhaltene Borane geschützte Phosphonit vollständig vom Kupfer-
Katalysator befreit werden konnte. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass sich
das neu entwickelte Syntheseprotokoll unter Verwendung der Alkinphosphonite
durch seine hohe Flexibilität bezüglich der einzuführenden funktionalen
Einheit und durch den einfachen und kurzen Syntheseweg auszeichnet. Diese
zweite Generation von Phosphoniten wurde in grundlegenden Studien bezüglich
der Zugänglichkeit von Triazol-Phosphoniten und deren Verhalten in der
Staudinger-Reaktion in organischen Lösungsmitteln untersucht. Es konnte
gezeigt werden, dass eine große Vielfalt an funktionalen Einheiten und sogar
ungeschützte Zuckerphosphonite zugänglich waren. All diese Phosphonite konnten
anschließend erfolgreich in Staudinger-Reaktionen mit unterschiedlichen Aziden
in sehr guten Ausbeuten umgesetzt. Darüber hinaus konnte auch ein
Azidopolyglycerol mit dem Laktose-Triazol-Phosphonit umgesetzt und ein
glykosyliertes Polymer erhalten werden. Anschließende SPR-Messungen zeigten
exzellente Bindung des Laktose-Phosphonamidat-Polyglycerol in einem Lektin-
peanut agglutinin (PNA) Bindingsassay. Allerdings wurde bei der Staudinger-
Phosphonit-Reaktion mit Arylaziden die Entstehung eines Arylamins beobachtet,
welches durch eine unselektive Hydrolyse des Phosphonimidates erklärt werden
kann. Diese Hypothese konnte mit Hilfe von 18O-markiertem Wasser bewiesen
werden. Dieses Resultat brachte neue Erkenntnisse bezüglich des Mechanismus
der Staudinger-Reaktion. Nach der erfolgreichen Verwendung der Alkin-
Phosphonite in organischen Lösungsmitteln, wurde die Reaktion auf wässrige
Puffersysteme übertragen. Dafür wurden Phosphonite sowohl mit mOEG als auch
mit p-Nitrobenzyl-Substituenten an den Sauerstoffen des Phosphonits
hergestellt, um die Wasserlöslichkeit und Stabilität der Phosphonite zu
verbessern. Diese neuen Phosphonite zeigten dabei eine drei- bis fünffach
höhere Stabilität gegen Hydrolyse. Ferner wurde die Umsetzung dieser
Phosphonite mit unterschiedlichen Azidopeptiden unter Veränderung der Azid-,
Phosphonit- und Pufferkonzentration sowie der pH-Werte untersucht und die
Umsetzung entweder mit HPLC-Fluoreszenz oder über quantitative
Massenspektrometrie analysiert. Diese Studien zeigten, dass das beste Ergebnis
der Staudinger-Phosphonit-Reaktion in einem 100 mM tris / HCl Puffer bei einem
pH-Wert von 8.2, einer Peptid Konzentration von 50 μM und 250 bis 500
Äquivalenten an Phosphonit erhalten werden konnte. Abschließend wurde die
Staudinger-Phosphonite-Reaktion mit Triazol-Phosphoniten zur biotinylierung
von Rasa1-N verwendet. Das biotinylierte Protein wurde auf magnetischen-Beads
immobilisiert um anschließend bindungsstudien mit phosphoryliertem ADAD-P
durchzuführen.
de
dc.format.extent
[17,] 187 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
chemoselective
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie
dc.title
Phosphonites as new Chemoselective Modification Tools in Staudinger Reactions
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Christian P. R. Hackenberger
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rainer Haag
dc.date.accepted
2013-10-31
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000095603-2
dc.title.translated
Phosphonite als neue chemoselektive Modifikationswerkzeuge in Staudinger-
Reaktionen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000095603
refubium.note.author
Aus Copyrightgründen sind die Zeitschriftenartikel hier nicht online
veröffentlicht.
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FUDISS_derivate_000000014439
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open access