dc.contributor.author
Schmidt, Marco
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:49:20Z
dc.date.available
2011-05-30T07:13:50.758Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5459
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9658
dc.description.abstract
In der hier vorliegenden Arbeit stand die Detektion niedrig affiner
Fragmentmoleküle über Templat-stabilisierte Ligationsprodukte im Mittelpunkt.
Konkret wurde die Frage gestellt, ob Imine, die erst durch das Wirkstoffziel
(Templat) stabilisiert werden, auch die Funktion der Template beeinflussen.
Wenn dies der Fall ist, kann man mit Hilfe einfacher bekannter, biochemischer
Funktionstests, sogenannten Assays, diese stabilisierten Ligationsprodukte
indirekt nachweisen und diese Information für die Inhibitorentwicklung nutzen.
Die oben gestellte Hypothese konnte bestätigt werden. Die auf dem
Wirkstoffziel reversibel gebildeten Ligationsprodukte hatten einen Einfluss
auf die Funktion des Proteins. Es war daher möglich, diese Ligationsprodukte
mit bekannten, biochemischen Funktions- und Bindungsstudien zu detektieren.
Diese Strategie, dynamisch gebildete Ligationsprodukte mit Hilfe biochemischer
Funktionstest zu identifizieren, wurde daher dynamisches Ligationsscreening
(DLS) genannt. Das dynamische Ligationsscreening wurde in dieser Arbeit an
mehreren Wirkstoffzielen erprobt. So konnte im Falle der SARS-Hauptprotease
(SARS-CoV Mpro) der nicht-peptidische Inhibitor 98 mit einem KI-Wert von 2,9
μM entwickelt werden. Dieser gehört zu den bisher besten Inhibitoren, die
gegen die SARS-CoV Mpro bekannt sind. Im Gegensatz dazu waren die gefundenen
Verbindungen gegen die HIV1-Protease nicht so aktiv wie die in der Literatur
beschriebenen. Dennoch kann die Verbindung 128 mit einer Aktivität von 890 nM
in Zukunft als potentielle Leitstruktur dienen und damit gegen aufkommende
Resistenzen eine Alternative darstellen. Das Ergebnis der Arbeiten zu der
Caspase 3 war die Verbindung 148. Diese stellte mit einer Aktivität von 0,08
nM den bisher besten bekannten Inhibitor dar. Zusätzlich konnte durch
Simulationen der dynamischen Ligation im Vergleich zu experimentellen Daten
auch ein Einblick gewonnen werden, wie das Ligationsprodukt wahrscheinlich auf
der Oberfläche des Proteins gebildet wird und nicht schon in Lösung. Letztlich
konnte die Verbindung 188 auch Lösungsansätze für das Problem der Entwicklung
von Phosphataseinhibitoren bieten. Durch das DLS wurden im Falle der MptpA
Fragmente für die benachbarte Tasche zum aktiven Zentrum identifiziert. Durch
synthetische Verknüpfung des gefundenen Fragments 159 mit einem
Phosphotyrosinmimetikum 189 konnte der hoch selektive MptpA-Inhibitor 188
entwickelt werden. Dieser zeigte eine Inhibitionskonstante von 10 µM gegen
MptpA. Als Fazit ist daher zu ziehen, dass der Nachweis von nieder affinen
Fragmente über Templat-stabilisierte Ligationsprodukte durch biochemische
Funktions- und Bindungsstudien möglich ist. Die allgemeine Anwendung dieser
Methode, des dynamischen Ligationssceenings (DLS), zur kostengünstigen und
schnellen Identifizierung neuer Leitstrukturen für potentielle Wirkstoffziele
konnte erfolgreich etabliert werden.
de
dc.description.abstract
Specific protein ligands are crucial for the modulation of protein activities
in medicinal chemistry and chemical biology. This dissertation presents a
concept for the discovery and development of small molecule fragments binding
to defined protein sites: Dynamic Ligation Screening enables the rapid and
site-directed identification of low-affinity binders in protein activity and
fluorescence polarization experiment by exploiting template-assisted fragment
assembly. Dynamic Ligation Screening (DLS) was conducted with libraries of
100-7000 fragments consuming only minor amounts of enzyme: A fluorogenic
protease substrate competed with an equilibrium of nucleophilic fragments and
a designed peptide electrophile for the active-site. Decreased initial rates
of product formation in the fluorophore-based enzyme assay indicated the
inhibitory activity of the reversibly formed ligation product. One selected
hit was modified synthetically in order to verify the binding site. Via an
iterative scanning of different binding sites on the protein surface,
moderately active peptidic inhibitors could be transformed into entirely non-
peptidic inhibitors with a low µM KI. The concept was established for the
development of a non-peptidic SARS coronavirus main protease (SARS-CoV Mpro)
inhibitor. This enzyme has been identified as a drug target of SARS being
essential for replication of the virus inside the infected host cell.
Thermodynamics of protein-assisted fragment ligations were studied for
caspase-3, the cellular switch for apoptosis, the programmed cell death. As a
result a model for the additivity of binding contributions of reversibly
ligated fragments is proposed and the most active inhibitor reported to date
was developed. The method was further extended to phosphatases. Herein, a
substrate activity ligation screen enables the development of a highly
selective inhibitor for the Mycobacterium tuberculosis proteintyrosin
phosphatase A (MptpA). The general application of dynamic ligation screening
(DLS) for the detection of low affinity binders could be established.
en
dc.format.extent
[4], X, 113 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Dynamische Chemie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie
dc.title
Dynamisches Ligationsscreening zur Identifizierung von Proteinliganden
dc.contributor.contact
mcschmidt@fmp-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Jörg Rademann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Wolfram Saenger
dc.date.accepted
2009-05-27
dc.date.embargoEnd
2011-05-27
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000010326-3
dc.title.translated
Dynamic ligation screening
en
dc.title.translatedsubtitle
a method for the sensitive detection of inhibitory fragments
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000010326
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005772
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access