In der hier vorliegenden Arbeit stand die Detektion niedrig affiner Fragmentmoleküle über Templat-stabilisierte Ligationsprodukte im Mittelpunkt. Konkret wurde die Frage gestellt, ob Imine, die erst durch das Wirkstoffziel (Templat) stabilisiert werden, auch die Funktion der Template beeinflussen. Wenn dies der Fall ist, kann man mit Hilfe einfacher bekannter, biochemischer Funktionstests, sogenannten Assays, diese stabilisierten Ligationsprodukte indirekt nachweisen und diese Information für die Inhibitorentwicklung nutzen. Die oben gestellte Hypothese konnte bestätigt werden. Die auf dem Wirkstoffziel reversibel gebildeten Ligationsprodukte hatten einen Einfluss auf die Funktion des Proteins. Es war daher möglich, diese Ligationsprodukte mit bekannten, biochemischen Funktions- und Bindungsstudien zu detektieren. Diese Strategie, dynamisch gebildete Ligationsprodukte mit Hilfe biochemischer Funktionstest zu identifizieren, wurde daher dynamisches Ligationsscreening (DLS) genannt. Das dynamische Ligationsscreening wurde in dieser Arbeit an mehreren Wirkstoffzielen erprobt. So konnte im Falle der SARS-Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) der nicht-peptidische Inhibitor 98 mit einem KI-Wert von 2,9 μM entwickelt werden. Dieser gehört zu den bisher besten Inhibitoren, die gegen die SARS-CoV Mpro bekannt sind. Im Gegensatz dazu waren die gefundenen Verbindungen gegen die HIV1-Protease nicht so aktiv wie die in der Literatur beschriebenen. Dennoch kann die Verbindung 128 mit einer Aktivität von 890 nM in Zukunft als potentielle Leitstruktur dienen und damit gegen aufkommende Resistenzen eine Alternative darstellen. Das Ergebnis der Arbeiten zu der Caspase 3 war die Verbindung 148. Diese stellte mit einer Aktivität von 0,08 nM den bisher besten bekannten Inhibitor dar. Zusätzlich konnte durch Simulationen der dynamischen Ligation im Vergleich zu experimentellen Daten auch ein Einblick gewonnen werden, wie das Ligationsprodukt wahrscheinlich auf der Oberfläche des Proteins gebildet wird und nicht schon in Lösung. Letztlich konnte die Verbindung 188 auch Lösungsansätze für das Problem der Entwicklung von Phosphataseinhibitoren bieten. Durch das DLS wurden im Falle der MptpA Fragmente für die benachbarte Tasche zum aktiven Zentrum identifiziert. Durch synthetische Verknüpfung des gefundenen Fragments 159 mit einem Phosphotyrosinmimetikum 189 konnte der hoch selektive MptpA-Inhibitor 188 entwickelt werden. Dieser zeigte eine Inhibitionskonstante von 10 µM gegen MptpA. Als Fazit ist daher zu ziehen, dass der Nachweis von nieder affinen Fragmente über Templat-stabilisierte Ligationsprodukte durch biochemische Funktions- und Bindungsstudien möglich ist. Die allgemeine Anwendung dieser Methode, des dynamischen Ligationssceenings (DLS), zur kostengünstigen und schnellen Identifizierung neuer Leitstrukturen für potentielle Wirkstoffziele konnte erfolgreich etabliert werden.
Specific protein ligands are crucial for the modulation of protein activities in medicinal chemistry and chemical biology. This dissertation presents a concept for the discovery and development of small molecule fragments binding to defined protein sites: Dynamic Ligation Screening enables the rapid and site-directed identification of low-affinity binders in protein activity and fluorescence polarization experiment by exploiting template-assisted fragment assembly. Dynamic Ligation Screening (DLS) was conducted with libraries of 100-7000 fragments consuming only minor amounts of enzyme: A fluorogenic protease substrate competed with an equilibrium of nucleophilic fragments and a designed peptide electrophile for the active-site. Decreased initial rates of product formation in the fluorophore-based enzyme assay indicated the inhibitory activity of the reversibly formed ligation product. One selected hit was modified synthetically in order to verify the binding site. Via an iterative scanning of different binding sites on the protein surface, moderately active peptidic inhibitors could be transformed into entirely non- peptidic inhibitors with a low µM KI. The concept was established for the development of a non-peptidic SARS coronavirus main protease (SARS-CoV Mpro) inhibitor. This enzyme has been identified as a drug target of SARS being essential for replication of the virus inside the infected host cell. Thermodynamics of protein-assisted fragment ligations were studied for caspase-3, the cellular switch for apoptosis, the programmed cell death. As a result a model for the additivity of binding contributions of reversibly ligated fragments is proposed and the most active inhibitor reported to date was developed. The method was further extended to phosphatases. Herein, a substrate activity ligation screen enables the development of a highly selective inhibitor for the Mycobacterium tuberculosis proteintyrosin phosphatase A (MptpA). The general application of dynamic ligation screening (DLS) for the detection of low affinity binders could be established.
