The contribution of mast cells to antiviral immune responses: Characterization and functional definition of receptor transporter protein 4 (RTP4)

Abstract

So far mast cells (MC) for their role in allergy have been considered “monotasking cells”. However, in the last years increasing evidence points out at the MC to participate in a variety of different immune responses. MC modulate the recruitment of immune cells to inflammation sites and control immune responses by the release of a wide variety of mediators. While new evidence supports the role of MC in the control of bacterial infections, the involvement of these cells in antiviral immune responses is still poorly investigated. Goal of this project was to investigate the response of mast cells to viral infection by analyzing the gene expression profile induced in these cells upon Newcastle disease virus (NDV), used here as a model for viral infection. Additionally, gene expression analysis showed that the gene rtp4, which codes for the protein receptor transporter protein 4, was the second most upregulated gene. Therefore the second aim of this work was to study the regulation and cellular localization of RTP4 as well as its functional contribution in antiviral immune responses. Gene expression analysis revealed that BMMC upregulate a wide variety of antiviral genes, as a consequence of the engagement of NDV to PRRs which can be classified as follow: (1.) immediate genes that enable MC to sense viral particles and to activate signaling pathways; (2.) effector genes that regulate and amplify the response and are responsible for the induction of type I interferons (IFN); and (3.) interferon stimulated genes that code for proteins that directly control viral replication, leading to the resolution of the infection. Expression of rtp4 was shown to be partially dependent on TLR2, TLR3, TLR4, TLR7 and TLR9 as well as the adaptor proteins MyD88 and TRIF. However, type I IFN receptor deficiency, correlates with the lack of rtp4 expression, indicating that type I interferons are responsible for its induction. Additionally, induction of rtp4 in BMMC was triggered by 116 Abstract NDV and influenza A virus (IAV) infection. Fractionation and confocal experiments localized RTP4 in the plasma membranes and in endoplasmic reticulum, early endosomes and lipid bodies, respectively. To investigate the functions of RTP4, knock-out mice were generated. rtp4-/- mice showed no obvious phenotypic abnormalities. Furthermore, gene expression analysis showed that rtp4-/- bone marrow derived MC (BMMC) express a comparable gene pattern to WT BMMC in response to NDV infection. Additionally, functional features of BMMC such as degranulation and cytokine production were similar to their counterpart WT BMMC. This work shows that virally infected MC develop an antiviral program to which the membrane- associated and IFN-induced RTP4 protein belongs.

Bislang wurden Mastzellen (MC) auf Grund ihrer der Allergie zugeschriebenen Rolle als "monotasking" Zellen betrachtet. Allerdings wurde in den letzten Jahren vermehrt gezeigt, dass MC in einer Vielfalt von verschiedenen Immunantworten eine Rolle spielen. MC modulieren die Rekrutierung von Immunzellen zum Entzündungsherd und kontrollieren Immunantworten durch die Ausschüttung vielfältiger Mediatoren. Während neue Hinweise die Rolle von MC bei der Kontrolle von bakteriellen Infektionen unterstützen, ist die Beteiligung dieser Zellen bei antiviralen Immunantworten immernoch geringfügig untersucht. Ziel dieser Arbeit war es, die Reaktion von MC auf virale Infektionen zu untersuchen. Dabei wurde das Newcastle disease virus (NDV) als Modell für virale Infektionen verwendet und das durch NDV indizierte Genexpressionsprofil der MC analysiert. Die Genexpressionsanalysen hatten gezeigt, dass das Gen rtp4, welches für das Rezeptor Transporter Protein 4 (RTP4) kodiert, am zweithöchsten hochreguliert war. Aus diesem Grund umfasste ein weiterer Teil dieser Arbeit die Regulation und zelluläre Lokalisation von RTP4 sowie dessen funktionale Rolle in antiviralen Immunantworten zu untersuchen. Genexpressionsanalysen zeigten, dass MC eine große Vielfalt antiviraler Gene hochregulieren, als Konsequenz der Bindung von NDV an "pattern recognition receptors" (PRRs), welche wie folgt klassifiziert werden können: (1.) direkte Gene, die MC befähigen virale Partikel wahrzunehmen und Signalwege zu aktivieren; (2.) Effektor-Gene, die die Antwort regulieren und verstärken und verantwortlich für die Induktion von Typ I IFN sind; (3.) Interferon-stimulierte Gene (ISG), die für Proteine kodieren, welche direkt die virale Replikation kontrollieren, was zur Auflösung der Infektion führt. Die Expression von rtp4 wurde als teilweise abhängig von TLR2, TLR3, TLR4, TLR7 und TLR9 sowie den Adaptorproteinen MyD88 und TRIF beschrieben. Typ I IFN-Rezeptor-Defizienz korreliert mit der fehlenden Expression von rtp4, was darauf hindeutet, dass Typ I Interferone verantwortlich für dessen Induktion sind. Zudem wurde gezeigt, dass die 114 Zusammenfassung Induktion von RTP4 in MC durch NDV und Influenza A virus (IAV) reguliert wird. Fraktionierungen und konfokalmikroskopische Analysen lokalisierten RTP4 in der Plasmamembran und dem endoplasmatischen Retikulum beziehungsweise in frühen Endosomen und Lipidkörpern. Um die Funktion von RTP4 zu untersuchen wurden "knock-out" Mäuse generiert. rtp4-/- Mäuse zeigten keine offensichtlichen phenotypischen Abnomalien. Zusätzlich zeigten Genexpressionsanalysen, dass rtp4-/- Mastzellen aus dem Knochenmark (BMMC) als Antwort auf eine NDV Infektion ein vergleichbares Genmuster exprimieren wie wildtypische (WT) BMMC. Die funktionalen Eigenschaften der rtp4-/- BMMC, wie Degranulation und Zytokinproduktion, waren ähnlich denen ihrem Gegenstück WT BMMC. Demzufolge verbleibt ungeklärt in welchem Schritt der antiviralen Immunkaskade RTP4 involviert ist. Diese Arbeit zeigt, dass viral infizierte MC ein antivirals Programm entwickeln zu dem das Membran-assoziierte und IFN-induzierte RTP4 Protein gehört.