In-vitro- und in-vivo-Untersuchungen zur Effizienz verschiedener mikrobieller Phytasen als Futterzusatzstoff

Abstract

Zwei E.coli-Phytasen (Optiphos und FB-Phytase) wurden hinsichtlich ihrer biochemischen Fähigkeiten untersucht (pH-Verhalten, Temperaturverhalten und –stabilität sowie proteolytische Stabilität), um deren Eignung als Futterzusatzstoff zu überprüfen. Als Vergleichsenzym wurde die kommerziell erhältliche Aspergillus-Phytase Natuphos® hinzugezogen. Die Ergebnisse zum pH- Verhalten zeigen, dass die pH-Optima der untersuchten Enzyme im sauren Bereich liegen. Die E.coli-Phytasen weisen ihre pH-Optima bei 4,5 und 5,0 auf, während Natuphos® die optimale Wirkung bei pH 5,5 zeigt. Im neutralen pH-Bereich sind alle Enzyme inaktiv. Das Temperaturoptimum der Phytasen wurde ermittelt, indem die Enzyme bei acht unterschiedlichen Temperaturen zwischen 30°C und 80°C in Natriumacetatpuffer mit dem für das jeweilige Enzym optimalen pH-Wert für 60 Minuten inkubiert wurden. Die anschließenden Aktivitätsbestimmungen zeigten, dass die Termeraturoptima für beide E.coli-Enzyme bei 55°C und für die Aspergillus-Phytase bei 50°C liegen. Die Temperaturstabilität der Phytasen wurde für drei unterschiedliche Temperaturen und jeweils für eine Gesamtdauer von 120 Minuten bestimmt. Die Enzyme wurden in Natriumacetatpuffer mit dem jeweils optimalen pH-Wert inkubiert und anschließend die Phytaseaktivität gemessen. Die Temperaturstabilitätsmessungen in wässriger Lösung zeigen, dass Natuphos® von den drei getesteten Enzymen am stabilsten, Optiphos hingegen am wenigsten stabil ist. Schon bei 20-minütiger Inkubation bei 50°C weist die Optiphos-Phytase unter 10% Restaktivität auf, FB-Phytase und Natuphos® hingegen noch 60% respektive 80% Restaktivität. Die Phytasen wurden ferner hinsichtlich ihrer Hitzestabilität beim Pelletiervorgang untersucht. Hierbei wurde als Vergleichsenzym die Peniophora-Phytase ZY-Phytase hinzugezogen. Die zu einem Mischfutter für Broiler supplementierten Phytasen wurden beim Pelletieren vier unterschiedlichen Temperaturen zwischen 55°C und 85°C ausgesetzt. Das E.coli-Enzym Optiphos (in der granulierten Form) war die stabilere der beiden E.coli-Phytasen. Bei 85°C wies dieses Enzym eine Restaktivität von 77% auf. Auch das Vergleichsenzym Peniophora war unter diesen Bedingungen stabil (96% Restaktivität bei 85°C). Die FB-Phytase war sowohl in granulierter Formulierung als auch in Pulverform bei 85°C inaktiv, aber auch die Pulverform des Optiphos-Enzyms war bei 85°C nicht stabil. Um die Widerstandsfähigkeit der Phytasen gegenüber Proteasen zu testen, wurden die Enzympräparate für 20 Minuten in wässriger Pepsin- bzw. Pankreatinlösung bei 40°C inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vergleichsenzym Natuphos® empfindlich gegenüber Pepsin, besonders aber gegenüber Pankreatin ist. Optiphos verlor in beiden Medien etwa 45% der Aktivität und ist somit nur mäßig stabil gegenüber proteolytischer Inaktivierung. FB-Phytase ist relativ unempfindlich gegenüber Inaktivierung durch Pepsin (etwa 74% Restaktivität), jedoch empfindlich gegenüber Pankreatin. Auch wurde der Einfluss von Digestaüberstand auf die Enzyme untersucht. Die Inkubationen erfolgten bei 40°C für 60 Minuten in der Digestalösung aus dem Magen und proximalem Jejunum vom Schwein. In der Magendigesta mit einem pH-Wert von 5,05 waren sowohl die Aspergillus-Phytase als auch die E.coli-Phytasen stabil. In der Jejunaldigesta (pH-Wert 6,34) waren die E.coli-Phytasen Optiphos und FB-Phytase mit Restaktivitäten von 35% und 38% eher instabil, Natuphos® zeigte hingegen mit 70% Restaktivität eine akzeptable Stabilität. Der Weg und die Effizienz des Substratabbaus der Aspergillus-, E.coli- und Bacillus-Phytasen wurden durch Inositolphosphatbestimmung mittels HPLC untersucht. Für jedes der zu prüfenden Enzyme wurde eine Enzymlösung hergestellt und diese mit Substratlösung (Natriumphytat) für unterschiedliche Zeiten (15, 45, 90 und 120 Minuten) bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion der Phytase gestoppt und die Inositolphosphatbestimmung mittels HPLC durchgeführt. Es konnte für die Aspergillus-Phytase ein Hauptabbauweg des Substrates über das 1,2,4,5,6-IP5 und das 1,2,5,6-IP4 bis zum 1,2,5-IP3 gefunden werden. Für das E.coli-Enzym Optiphos wurde mittels HPLC ein Weg des Substratabbaus vom IP6 zum 1,2,3,4,5-IP5 und dann über das 2,3,4,5-IP4 zum 2,4,5-IP3 gefunden. Der Abbauweg der Bacillus amyloliquefacens-Phytase konnte wie folgt dargestellt werden: IP6, 1,2,4,5,6-IP5, 2,4,5,6-IP4. Die E.coli-Phytase war von den drei untersuchten Enzymen am schnellsten und am effizientesten beim Substratabbau: schon nach 90 Minuten war das Substrat komplett abgebaut und auch das Abbauprodukt IP5 war nicht mehr vorhanden. Weder die Aspergillus- noch die Bacillus-Phytase konnten IP6 komplett abbauen, zudem fand der Substratabbau deutlich langsamer statt als bei der E.coli-Phytase. Um die Möglichkeit einer Synergie zwischen der Optiphos- und der Bacillus-Phytase hinsichtlich des Phytatabbaus zu prüfen, wurden diese beiden Enzyme nacheinander zum Phytatabbau eingesetzt und das Ergebnis anschließend durch die Bestimmung der Inositolphosphate im HPLC untersucht. Zunächst wurde das Enzym Optiphos für 60 Minuten mit Natriumphytat inkubiert, anschließend die Reaktion gestoppt und dieselbe Probe mit dem Bacillus-Enzym nochmals für 45 respektive 90 Minuten inkubiert. Beim Abbau des Substrates konnten durch kombinierten Einsatz der E.coli- und Bacillus-Phytase deutliche Verbesserungen gezeigt werden: Beide Phytasen agierten in diesem Versuch synergistisch und konnten somit den Phytatabbau im Vergleich zur Wirkung einer einzelnen Phytase optimieren. Die in-vivo-Studie wurde konzipiert, um den dosisabhängigen Effekt von Optiphos in den hauptsächlich aus Mais und Optigrain bestehenden Diäten für Ferkel zu bestimmen. Die Diäten hatten eine marginale Ca- und P-Versorgung und wurden während der sechswöchigen Fütterungsperiode (24.-65. Lebenstag der Ferkel) ohne oder mit Phytasesupplementierung zu der Basaldiät mit den Enzymen Optiphos (bakterieller Ursprung aus E.coli) und Natuphos® (pilzlicher Ursprung aus Aspergillus niger) in Dosierungen von 125, 250, 500 und 1000 FTU/kg Futter verabreicht. Das Fütterungsexperiment hatte zum Ziel, die Effizienz der bakteriellen E.coli-Phytase in abgestuften Konzentrationen auf verschiedene Leistungsparameter im Vergleich zur pilzlichen Phytase oder der Negativkontrolle ohne Enzymsupplementierung einschätzen zu können. Die untersuchten Leistungsparameter waren Wachstum, Gewichtszunahme, Futteraufwand, Kotkonsistenz sowie die scheinbare Verdaulichkeit mit Fokus auf Kalzium, Phosphor und Rohasche. Das E.coli-Enzym Optiphos war im Fütterungsversuch im Hinblick auf Leistung und scheinbare Verdaulichkeit ebenso effektiv wie das kommerziell erhältliche Natuphos®: Der positive Effekt auf die Gewichtszunahme war sowohl bei Natuphos® als auch bei Optiphos am ausgeprägtesten während der dritten bis sechsten Woche des Experiments. Beide Enzyme zeigten einen gleichermaßen positiven Einfluss auf die Gewichtszunahme bei Absatzferkeln. Im Vergleich zur unsupplementierten Diät konnte der Zusatz von 1000 FTU/kg von Optiphos und Natuphos® die Futteraufnahme signifikant erhöhen. Die Ergebnisse der Bestimmung des MCP-Äquivalents zeigen, dass bis zum Level von 500 FTU/kg Optiphos effizienter ist und im Gegensatz dazu Natuphos® bei einem Gehalt von 1000 FTU/kg überlegen ist. Bei Zugabe niedrigerer Mengen unterhalb von 1000 FTU/kg ist Optiphos bei der Verbesserung der P-Verdaulichkeit überlegen (das optimale Level ist die Zugabe von 800 FTU/kg).

Two E.coli phytases (Optiphos and FB-Phytase) were examined regarding their biochemical abilities (pH behaviour, temperature behaviour and –stability as well as proteolytic stability) to validate their suitability as feed additives. The commercially available Aspergillus phytase Natuphos® has been consulted as the comparing enzyme. The results of the pH behaviour show that the pH optimum of the examined enzymes is located in the acidic range. The optimal pH values of the E.coli phytases are 4.5 and 5.0, whereas Natuphos® shows the best effect at pH 5.5. In the neutral pH range all enzymes are inactive. The temperature optimum for the phytases was determined by incubating the enzymes in a sodium acetate buffer with the optimal pH value for each of the enzymes at eight different temperatures in the range of 30°C to 80°C for 60 minutes. The subsequent determination of the phytase activity showed a temperature optimum at 55°C for both E.coli phytases and an optimal temperature of 50°C for the Aspergillus enzyme. The temperature stability of the phytases was determined for three different temperatures and with a total period of 120 minutes. The enzymes were incubated in sodium acetate buffer with the optimal pH value for each of the enzymes. Afterwards the phytase activity was determined. The measurements of temperature stability in aqueous solution show that Natuphos® ist the most stable of the three examined enzymes, whereas Optiphos is the least stable one. After 20 minutes of incubation at 50°C Optiphos already has a residual phytase activity of less than 10%, however FB-Phytase and Natuphos® exhibit residual activities of 60% and 80% respectively. The phytases were also examined regarding their heat stability during the pelleting process. In this case the Peniophora phytase ZY-Phytase was consulted as the comparing enzyme. The phyases were added to a mixed ration for pigs which was exposed to four different temperatures between 55°C and 85°C while pelletizing. The E.coli enzyme Optiphos (in the granulated form) was the more stable E.coli phytase. At 85°C this enzyme had a residual activity of 77%. The comparing enzyme Peniophora was also stable under these conditions (96% residual activity at 85°C). The FB-Phytase was inactivated at 85°C both in the granulated form and as powder. The powder form of the Optiphos enzyme was also not stable at 85°C. To assay the resistance of the phytases against proteases the enzyme preparations were incubated in an aqueous pepsin- or pancreatin solutionat 40°C. The results show that the comparing enzyme Natuphos® is sensitive to pepsin but even more sensitive to pancreatin. Optiphos lost about 45% of its activity in both media and is therefore only moderately resistant to proteolytic inactivation. FB-Phytase is relatively insensitive towards the pepsin inactivation (about 74% residual activity). The influence of digesta supernatant on the enzymes has been tested as well. The incubations were carried out at 40°C for 60 minutes in a digesta solution from the stomach and proximal jejunum of a pig. In the digesta of the stomach with a pH value of 5.05 the Aspergillus phytase as well as the E.coli phytases were stable. The E.coli phytases Optiphos and FB-Phytase were instable in the digesta of the jejunum (pH value 6.34) and showed residual activities of 35% and 38% respectively. Natuphos® showed a reasonable stability with 70% residual activity. The pathway as well as the efficiency of dephosphorylation of the Aspergillus-, the E.coli- and the Bacillus phytases were assayed by determining the inositolphosphates using HPLC. For every analysed enzyme an enzyme solution was prepared and then incubated at 37°C with a substrate solution (sodium phytate) for different periods (15, 45, 90 and 120 minutes). Subsequently the phytase reaction was stopped and the determination of the inositolphosphates by use of HPLC was conducted. For the Aspergillus phytase a main pathway of the substrate dephosphorylation has been found, wich leads to the 1,2,5-IP3 via 1,2,4,5,6-IP5 and 1,2,5,6-IP4. The pathway for the E.coli enzyme Optiphos leads from the IP6 via 1,2,4,5,6-IP5 and 2,3,4,5-IP4 to the 2,4,5-IP3. The pathway of dephosphorylation of the Bacillus amyloliquefaciens phytase can be constituted as follows: IP6, 1,2,4,5,6-IP5, 2,4,5,6-IP4. The E.coli phytase was the fastest and most efficient enzyme for substrate degradation of the three assayed enzymes: after 90 minutes the substrate was already completely degraded and the degradation product IP5 was also inexistent. Neither the Aspergillus phytase nor the Bacillus phytase were able to degrade the IP6 completely, moreover the substrate degradation proceeded obviously more slowly than in case of the E.coli phytase. To verify the possibility of a synergy of the Optiphos- and the Bacillus phytase concerning the phytate degradation, the two enzymes were applied successively for phytate degradation. The result was analysed via determination of inositolphosphates using HPLC. At first the Optiphos enzyme was incubated with sodium phytate for 60 minutes, then the reaction was stopped and the same sample was incubated with the Bacillus enzyme for 45 or 90 minutes respectively. By combined application of both the E.coli- and the Bacillus phytase notable improvements in substrate degradation could be demonstrated: Both phytases acted out synergetically in this trial and were therefore able to optimise phytate degradation in comparison to the effect of a single phytase. The in vivo study was conducted to determine the dose dependent effect of Optiphos in the diets for piglets containing mainly corn and Optigrain. The diets had a marginal Ca- and P supply and were fed to the piglets with or without phytase supplementation with the enzymes Optiphos (bacterial origin from E.coli) and Natuphos® (fungal origin from Aspergillus niger) during a six-week feeding period (24th to 65th days of life) in dosages of 125, 250, 500 and 1000 FTU/kg. The study aimed to assess the efficacy of the bacterial phytase at graded levels in comparison to the fungal phytase or the negative control without enzyme supplementation on performance parameters. The determined performance parameters were growth, weight gain or feed efficiency, faecal consistency and apparent digestibility with focus on calcium, phosphorus and crude ash. In the feeding trial the E.coli enzyme Optiphos was as effective as the commercial Natuphos® regarding the performance and apparent digestibility. The most positive effect on weight gain was observed during the 3rd to 6th week of the experiment. Both enzymes showed an equally positive influence on weight gain in weaning piglets. In comparison to the unsupplemented diet the supplementation of 1000 FTU/kg of both Optiphos and Natuphos® is able to increase the feed intake significantly. The results from the determination of the MCP equivalent show that up to a level of 500 FTU/kg Optiphos was more efficient. In contrast to this Natuphos® is superior at a level of 1000 FTU/kg. With addition of levels below 1000 FTU/kg Optiphos is superior in the improvement of phosphorus digestibility (the optimal level is the addition of 800 FTU/kg).