The field of molecular phylogenetics has benefited greatly from the recent advances of modern sequencing approaches that allow for the generation of large genomics data sets Nonetheless a lack of suitable genetic markers and incomplete taxon sampling remain common problems in studies of evolutionary relatedness. Most phylogenetic studies are based on mitochondrial DNA (mtDNA) because information about the nuclear genome and strategies to develop new genetic markers are often not available. The use of appropriate genetic markers and the inclusion of both a geographically and phylogenetically comprehensive taxon sampling are required for adequately reconstructing evolutionary histories among different taxa. This is particularly true for studies of recent diversification. Mayflies (Ephemeroptera) are ancient freshwater insects, dating back more than 300 million years, but at the same time have been reported to successfully colonize and diversify on recently formed Atlantic oceanic islands. This combination of ancient origin and recent diversification makes them a fascinating study system for molecular phylogenetics. In the first part of my thesis, I investigated the recent diversification and colonization history of mayflies on 13 Atlantic oceanic islands of the Azores, Madeira, and the Canary Islands. The island fauna provides an ideal setting to understand how speciation and dispersal shape present-day freshwater biodiversity. A first step in the research was an assessment of the species richness of the island fauna, because current taxonomic estimates are uncertain. Earlier research on mayflies in Europe, Africa, Madagascar, and North America has repeatedly uncovered otherwise cryptic diversity based on analysis of mtDNA. This suggests that past morphological estimates may underestimate species richness, and that a comprehensive understanding of island biodiversity and its evolution requires molecular-based taxonomy. In order to assess the biodiversity and date the origin of the island fauna, I used phylogenetic analyses based on universal mtDNA markers combined with a generalized mixed Yule- coalescent (gmyc) approach. In total, I found twelve island-endemic species within three species groups (Baetis canariensis s.l., B. pseudorhodani s.l., and Cloeon dipterum s.l.) that have diversified within the last 15 million years in parallel throughout the island archipelagos. While intriguing, the results also pointed out the limitations of mtDNA markers for the study of recent diversification events. The study clearly demonstrated a need for the development of new genetic markers that provide increased phylogenetic signal in order to resolve the relationships of closely related species groups. To investigate relationships among newly diverged species, many polymorphisms are needed, and these should ideally be derived from multiple unlinked markers. Since mayflies are a non-model organism i.e. no reference genome is available, I generated a whole genome draft and used these data to design 59 nuclear DNA (nDNA) markers to establish a basis for inferring the evolutionary history of the C. dipterum s.l. species group. Prior to my work, there were only two suitably variable nuclear markers available, namely 28S ribosomal RNA (rRNA) and PEPCK. I applied species tree reconstruction methods using the multispecies coalescent approach, a phylogenetic framework developed within the last five years and suitable for large nDNA data sets. This model was used to overcome both the lack of phylogenetic signal and the potentially conflicting signal derived from gene tree incongruences. Using this approach, I delineated six different Cloeon species, three on the islands and three on the European mainland. The phylogeny resolved complex colonization routes on a large geographic scale (Macaronesian islands, the European mainland and North America). The three Macaronesian Cloeon species appear to have originated from European source populations and different species co-occur in the same freshwater habitats. The diversification within the C. dipterum s.l. species group was mainly promoted by allopatric speciation, whereby strong natural selection on ecological traits i.e. freshwater habitat adaptations and shifts in life history traits are presumed to play a key role. Future research identifying specific ecological, morphological, or behavioral traits, as well as genes that are under natural selection will be needed to understand the mechanistic basis of speciation. The second part of my thesis focused on evolution over much longer temporal scales, namely ancient origins of the extant winged insects. It remains one of the open questions in the field of insect evolution and systematics, and is thought to act as foundation to understand the evolution of flight as one of the most fascinating evolutionary processes, leading to the development of the most diverse and successful animal group. All winged insects (Pterygota) are placed into one of two groups, based on wing function. The inability to fold back the wings, as seen in the Ephemeroptera and Odonata (dragonflies and damselflies), is considered to be an ancestral condition and these orders are therefore referred to as the Palaeoptera (old wings). In contrast, all other orders are able to fold their wings and as such referred to as Neoptera (new wings). The phylogenetic position of the Palaeoptera within the winged insects is one of the unresolved problems in insect systematics and is thus referred to as the ‘Palaeoptera problem’. Morphological and molecular data have provided support for three competing hypotheses: (1) the Palaeoptera hypothesis, stating the Ephemeroptera + Odonata as sister group to the Neoptera, (2) the basal Ephemeroptera hypothesis (Ephemeroptera + (Odonata + Neoptera)), and (3) the basal Odonata hypothesis (Odonata + (Ephemeroptera + Neoptera)). To date molecular phylogenetic reconstructions have been inferred with a limited number of genes, mostly mitochondrial and ribosomal genes, or a limited number of mayfly taxa (i.e. phylogenomic studies). To resolve the ‘Palaeoptera problem’, I increased the taxon sampling to a total of 93 insect taxa, including 19 mayflies and I used as marker the protein-coding regions of the mitochondrial genomes (mitogenomes) in order to overcome the highly sensitive sequence alignment step. I applied two different phylogenetic tree reconstruction methods, namely Bayesian inference and maximum-likelihood. I identified taxa with unstable topological positions under the different statistical models, and tested the effects of excluding these taxa on the overall phylogenetic accuracy. First, I sequenced and annotated the mitogenomes of the three mayfly species Baetis rutilocylindratus, Cloeon dipterum, and Habrophlebiodes zijinensis. A comparison among mayfly mitogenomes showed that the gene content and gene orientation was conserved, including 37 protein- coding genes and low AT content. I found that the pruning of identified problematic taxa greatly improved the node support values of the tree reconstruction. Interestingly, also the chosen outgroup was identified as being a problematic taxon. The Bayesian inferences provided support for the basal Ephemeroptera hypothesis, whereas the maximum- likelihood phylogeny supported the basal Odondata hypothesis. The increased number of taxa, the exclusion of problematic taxa and the use of mitogenomes proved to be well suited to reconstruct ancient relationships. The contradicting results of the two phylogenetic methods support the growing evidences that phylogenetic methods based on Bayesian inference might be more appropriate for reconstructing ancient relationships. Thus, the relationships of the Palaeoptera remained unresolved but the results point out the need to investigate the suitability of currently used phylogenetic methods for resolving ancient splits. Taken together, my thesis presents one of the first genetically comprehensive studies on aquatic insects, combining molecular phylogenetic approaches based on a large set of nDNA markers and mitogenomes. I found that the increase of nDNA markers and the development of bioinformatics approaches for recently evolved species groups and the use of mitogenomes for ancient taxa are extremely important for understanding evolution because of their capacity to reconstruct well supported phylogenetic trees.
Das Feld der molekularen Phylogenetik hat bei der Generierung großer Mengen genomischer Daten stark von den aktuellen Fortschritten moderner Sequenzierungstechnologien profitiert. Dennoch mangelt es oft an geeigneten genetischen Markern und ausreichender Taxon-Abdeckung. Die meisten phylogenetischen Studien basieren auf mitochondrieller DNA (mtDNA), weil genomische Information und Strategien zur Entwicklung neuer genetischer Marker oft nicht verfügbar sind. Die Verwendung angemessener, genetischer Marker und die Einbeziehung sowohl umfassender geografischer und phylogenetischer Taxon- Proben sind Voraussetzungen zur adäquaten Rekonstruktion evolutionärer Entwicklungen unterschiedlicher Abstammungslinien. Eintagsfliegen (Ephemeroptera) sind Süßwasserinsekten, deren Ursprung über 300 Millionen Jahre zurück liegt, welche sich erfolgreich spezialisieren und atlantische Inseln kolonisieren konnten. Diese Kombination aus ursprünglicher Herkunft und aktueller Diversifikation macht sie zu einem faszinierenden Studiensystem für die molekulare Phylogenetik. Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich die aktuelle Diversifikation und Kolonisierungsgeschichte der Eintagsfliegen auf 13 atlantischen Inseln der Azoren, Madeira und der Kanarischen Inseln untersucht. Die Inselfauna bietet ideale Voraussetzungen, um zu verstehen, wie Speziation und Ausbreitung die heutige Süßwasser-Biodiversität geformt haben. Ein erstes Zwischenziel der Forschungsarbeit war die Erfassung der Artenvielfalt der Inselfauna, denn aktuelle taxonomische Einschätzungen sind unsicher und werden hinterfragt. Frühere Untersuchungen über Eintagsfliegen in Europa, Afrika, Madagaskar und Nordamerika, die auf Analysen mittels mtDNA basieren, haben wiederholt eine andernfalls kryptische Diversität aufgedeckt. Dies suggeriert, dass vorherige morphologische Einschätzungen möglicherweise die Artenvielfalt unterschätzten, und dass ein umfassendes Verständnis von Biodiversität und Evolution auf endemischen Inseln molekularbasierte, taxonomische Untersuchungen erfordern. Um die Biodiversität zu bewerten und die Entstehung der Inselfauna zu datieren, habe ich phylogenetische Analysen durchgeführt, basierend auf universeller mtDNA Markern in Kombination mit einem "generalized mixed Yule-coalescent" (gmyc) Ansatz. Insgesamt fand ich zwölf insel-endemische Spezies in drei Spezies-Gruppen (Baetis canariensis s.l., B. pseudorhodani s.l. und Cloeon dipterum s.l.), die sich innerhalb der letzten 15 Millionen Jahre parallel auf den Insel-Archipelen diversifiziert haben. Obwohl aufschlussreich, unterstreichen die Ergebnisse dennoch die Notwendigkeit der Entwicklung neuer genetischer Marker, die ausreichende, phylogenetische Informationen enthalten, um die Verwandtschaftsverhältnisse der identifizierten, nahverwandten Speziesgruppen zu rekonstruieren. Um die Verwandtschaft zwischen neu-divergierenden Spezies zu untersuchen, sind viele Polymorphismen nötig, und diese sollten idealerweise von einer Vielzahl unabhängigen Marker abstammen. Da Eintagsfliegen keinen Modellorganismus darstellen, weil kein Referenzgenom existiert, erstellte ich einen Ganzgenom- Draft. Dieses benutzte ich als Basis für 59 nukleäre DNA (nDNA) Marker zur Inferenz der Evolutionsgeschichte der C. dipterum s.l. Speziesgruppe). Vor meiner Arbeit gab es lediglich zwei geeignete nDNA Marker: 28S ribosomale RNA (rRNA) und PEPCK. Ich wendete Artbaum Rekonstruktionsmethoden mit einem "multispecies coalescent"-Modell an, ein Ansatz, der in den letzten 5 Jahren entwickelt wurde und zur Analyse von großen nDNA Daten geeignet ist. Dieses Modell wurde gewählt, um sowohl den Mangel an phylogenetischem Signal zu bewältigen als auch um das widersprüchliche phylogenetische Signal aufgrund von Genbaum-Inkongruenzen zu überwinden. Ich grenzte sechs verschiedene Cloeon-Spezies ab, drei auf den Inseln und drei auf dem europäischen Festland. Die Phylogenetik konnte Kolonisationsrouten im großen geographischen Maßstab (Makaronesische Inseln, europäisches Festland und Nordamerika) rekonstruieren. Dabei scheint es, dass die drei makaronesischen Cloeon Spezies von europäischen Ursprungspopulationen abstammen, und Speziespaare in den selben Süßwasserhabitaten vorkommen. Die Diversifizierung innerhalb der C. dipterum s.l. Speziesgruppe wurde wesentlich durch allopatrische Speziation angetrieben, wobei starke natürliche Selektion ökologischer Merkmale (d.h. Süßwasserhabitat-Anpassung) und Verschiebungen von Lebenszyklus-Merkmalen vermutlich eine Schlüsselrolle spielten. Zukünftige Forschung zur Identifikation spezifischer Gene, die unter natürlicher Selektion stehen, und vergleichende Studien einschließlich morphometrischer und ökologischer Analysen werden nötig sein, um die grundlegende Basis von Speziationsmustern zu verstehen. Der zweite Teil ist fokussiert auf den historischen Ursprung der heute lebenden geflügelten Insekten als eine der verbleibenden offenen Fragen in der Insektensystematik. Die Beantwortung bietet gleichsam das Fundament zum Verständnis der Evolution des Fluges als einem der faszinierendsten evolutionären Prozesse, der zur Entwicklung einer außerordentlich mannigfaltigen und erfolgreichen Tiergruppe geführt hat. Die geflügelten Insekten (Pterygota) werden in zwei Gruppen eingeteilt, basierend auf der Funktion ihrer Flügel. Die Unfähigkeit, ihre Flügel zurück zu falten, wie bei den Ephemeroptera und Odonata (Libellen) vorkommend, wird als ursprüngliche Eigenschaft betrachtet; sie werden daher als Palaeoptera (Altflügler) bezeichnet, im Gegensatz zu den Neoptera (Neuflügler), die jene Fähigkeit besitzen. Dabei ist die phylogenetische Stellung der Palaeoptera innerhalb der geflügelten Insekten eines der ungeklärten Probleme der Insektensystematik und wird daher als sogenanntes "Palaeoptera-Problem" bezeichnet. Morphologische und molekulare Daten haben Anhaltspunkte für drei konkurrierende Hypothesen geliefert: (1) die "Palaeoptera"-Hypothese, die Ephemeroptera + Odonata als Schwestergruppe zu den Neoptera beschreibt, (2) die "basale Ephemeroptera"-Hypothese (Ephemeroptera + (Odonata + Neoptera)) und (3) die "basale Odonata"-Hypothese (Odonata + (Ephemeroptera + Neoptera)). Bisher wurden molekular-phylogenetische Rekonstruktionen mit einer begrenzten Anzahl an Genen, hauptsächlich mitochondrielle und ribosomale Gene, oder mit einer geringen Anzahl an Taxa (d.h. phylogenomische Studien) durchgeführt. Bisher wurden molekular-phylogenetische Rekonstruktionen mit einer begrenzten Anzahl an Genen, hauptsächlich mitochondrielle und ribosomale Gene, oder mit einer geringen Anzahl an Taxa (d.h. phylogenomische Studien) durchgeführt. Um das "Palaeoptera-Problem" aufzuklären, intensivierte ich das Taxon-Sampling zu einer Gesamtzahl von 93 Insekten-Taxa, inklusive 19 Eintagsfliegen. Als Marker wählte ich mitochondrielle Genome (Mitogenome), um den kritischen Schritt des Sequenz- Alignment zu bewältigen. Ich wendete zwei verschiedene phylogenetische Baum- Rekonstruktionsmethoden an, und zwar die Bayesian Inference und die Maximum Likelihood Methoden. Ich identifizierte Taxa mit unbeständiger, topologischer Positionierung unter den verschiedenen, statistischen Modellen und untersuchte die Effekte des Entfernens dieser Taxa auf die insgesamte phylogenetische Präzision. Zuerst sequenzierte und annotierte ich die Mitogenome der drei Eintagsfliegen-Spezies Baetis rutilocylindratus, Cloeon dipterum und Habrophlebiodes zijinensis. Ein Vergleich mit bekannten Eintagsfliegen-Mitogenomen zeigte die Konservierung von Genumfang und - orientierung, mit 37 proteinkodierenden Genen und geringem AT-Gehalt. Ich fand heraus, dass das Entfernen der als problematisch identifizierten Taxa den Knoten-Support der Baum-Rekonstruktion stark verbessert. Interessanterweise wurde auch die gewählte Außengruppe (outgroup) als problematisches Taxon identifiziert. Die Bayesian Inference Methode unterstützte die "basale Ephemeroptera"-Hypothese, wohingegen die Maximum Likelihoood Phylogenie die "basale Odonata"-Hypothese unterstützte. Die höhere Anzahl an Taxa, das Ausschließen problematischer Taxa und die Verwendung von Mitogenomen erwies sich als gut geeignet, um ursprüngliche Verwandtschaftsverhältnisse zu rekonstruieren. Die widersprüchlichen Ergebnisse der beiden phylogenetischen Methoden verstärken weiter die zunehmenden Hinweise, dass auf Bayesian Inference basierende Methoden angemessener sind für die Rekonstruktion historischer Artverwandtschaften. Insgesamt können meine Ergebnisse das "Palaeoptera Problem" nicht lösen. Die Ergebnisse belegen aber das Potential und die Notwendigkeit, heute genutzte, phylogenetische Methoden zur Aufklärung ursprünglicher Aufspaltungen einzusetzen. Zusammenfassend stellt meine Arbeit eine der ersten, genetisch umfassenden Studien über aquatische Insekten dar, die molekulare, phylogenetische Ansätze basierend auf einer großen Anzahl kombinierter nDNA Marker und Mitogenomen einsetzt. Die Ergebnisse zeigen eindrücklich, dass die Hinzunahme von nDNA Markern und die Entwicklung von bioinformatischen Methoden innerhalb nah verwandter Arten sowie die Verwendung von Mitogenomen für alte Gruppen, aufgrund ihrer Fähigkeit zur Rekonstruierung von phylogenetischen Stammbäumen, sehr wichtig sind, um die Evolution zu verstehen.
