Spendervorbehandlung mit warmer HTK-Lösung im Lebertransplantationsmodell der Ratte reduziert den Ischämie/Reperfusions-Schaden

Abstract

Durch die Verbesserung der Ergebnisse der Lebertransplantation in den letzten Dekaden hat sich ein schwerwiegender Organ-Mangel entwickelt. Dies führt zu einer zunehmenden Anzahl an Transplantationen von Organen sog. ‚marginaler Spender‘. Diese Organe sind empfindlicher gegenüber durch Ischämie und Reperfusion verursachter Schäden. Verbesserungen der Organkonservierung sind zu einer Ausweitung des Spenderpools um ‚marginale Spender‘ unbedingt erforderlich. Ein neuer Verbesserungsansatz ist die Vorbehandlung der Spender mit warmer (21°C) HTK-Lösung. In der vorliegenden Arbeit erfolgte in einem etablierten Lebertransplantationsmodel mit männlichen Inzucht Wistarratten (KG 230-260g) die Vorbehandlung der Spender mit warmer (21°C) HTK-Lösung, bzw. in den Kontrollgruppen mit warmer (21°C) NaCl 0,9% Lösung. Nach Vorbehandlung mit HTK bzw. NaCl erfolgte bei Behandlungs- und Kontrolltieren die Perfusion mit kalter (4°C) HTK-Lösung sowie die Explantation und kalte Lagerung in HTK für sechs Stunden, gefolgt von der Lebertransplantation. Die transplantierten Tiere wurden zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten (vier Stunden, zwei Tage, fünf Tage) getötet und Blutproben hinsichtlich AST, ALT, LDH und Bilirubin, sowie Leber-Gewebeproben hinsichtlich histologischem Schaden (mittels eines semiquantitativen Scores) und Matrixmetalloproteinasen-Aktivität (proMMP-2/MMP2, pro-MMP-9) mittels Zymografie analysiert. Dies resultierte in sechs untersuchten Behandlungs- bzw. Kontrollgruppen á sechs Versuchstieren. Die Vorbehandlung mittels warmer (21°C) HTK-Lösung war einfach durchführbar und führte bei keinem der Versuchstiere zu unerwünschten Nebenwirkungen. Die Behandlungsgruppen zeigten eine signifikant niedrigere Freisetzung der Schädigungsparameter ALT und LDH vier Stunden nach der Transplantation, sowie eine Tendenz zu niedrigeren Werten der AST vier Stunden, zwei und fünf Tage und der ALT zwei Tage post transplantationem im Vergleich mit den Kontrolltieren. Des Weiteren zeigte sich bei den Behandlungsgruppen eine signifikant niedrigere Aktivität der proMMP-2 im Lebergewebe zwei und fünf Tage nach Transplantation sowie der MMP-2 und proMMP-9 zwei Tage nach der Transplantation. Eine Tendenz zu niedrigerer Aktivität der MMPs bei den Behandlungsgruppen bestand für die MMP-2 nach vier Stunden und fünf Tagen sowie für die proMMP-9 nach fünf Tagen gegenüber den jeweiligen Kontrollgruppen. Die histologische Analyse zeigte ebenfalls eine Tendenz zu einer geringeren Schädigung nach zwei und fünf Tagen für die Behandlungsgruppen, allerdings ohne Signifikanz. In der vorgelegten Arbeit konnte somit eine verbesserte Konservierung durch Vorbehandlung der Spendertiere mit warmer (21°C) HTK-Lösung gezeigt werden. Untersuchungen mit tatsächlich marginalen Spendertieren könnten die These der Protektion durch Spendervorbehandlung mit warmer HTK-Lösung noch ausbauen und in der Folge zu einer Vergrößerung der Anzahl transplantierbarer Organe führen.

Improved outcomes after liver transplantation during the last decades have led to an alarming ‚organ shortage‘. Thus more transplantations of extended critiria donor (ECD) livers are performed. Those ECD organs are more susceptible to ischemia-reperfusion injury. Improvement of preservation procedures for those vulnerable organs are needed. A new concept is pre- treatment of donors with 21°C warm HTK-solution. This study investigated the warm (21°C) HTK donor pre-treatment in a well established rat liver transplantation model. Male inbred Wistar rats (bodyweight 230-260g) served as donors and recipients (n=6/group). Donors of the treatment groups received i.v. 0.01 ml/kg BW warm (21°C) HTK 15 min. prior to perfusion, whereas donors of the control groups recieved 0.01 ml/kg BW warm (21°C) NaCl 0.9%. Following pre-treatment procedures the perfusion was performed with 4°C cold HTK solution. Livers were then harvested and soterd at 4°C in cold HTK for 6 hours. Thereafter orthotopic liver transplantation was performed. According to three different groups animals were harvested four hours, two and five days after reperfusion and blood and liver tissue samples (snap frozen and formalin fixed) were stored. Blood samples were analyzed for AST, ALT Bilirubin and LDH, snap frozen liver tissue was analyzed for proMMP-2, MMP-2 and pro-MMP-9, MMP-9 using zymography. Formalin fixed samples were used for histological evaluation using hematoxilin eosin staining and histological damage was asessed blinded by a pathologist using a semi-quantitative score. Warm HTK pre-treatment proved to be feasable and did not cause any severe side effects that would impair the organ procurement procedure. Treatment groups showed significant lower values vs. control groups concerning ALT and LDH four hours post transplantation as well as a trend to lower values of AST four hours, two and five days after transplantation Moreover in treatment groups significantly lower activities of pro-MMP2 two and five days after transplantation as well as of MMP-2 and proMMP-9 two days post transplantation were detected. A trend to lower activities in livers of pre-treated animals was found for MMP-2 after four hours and five days as well as for proMMP-9 after five days. Histological analyses revealed a trend to minor damage in pre-treated groups after two and five days without significance. In conclusion, our study showed a better preservation by using warm (21°C) HTK donor pre-treatment. Further studies using real marginal donors (e.g. fatty livers of zucker rats or non- heartbeating donor rats) may underline our thesis of better protection of vulnerable ECD organs by warm HTK pre-treatment and might lead to an extension of the donor pool.