HIV-typische Zytokine beschleunigen die Restitution kultivierter Kolonepithelzellen

Abstract

Das mukosale Epithel des Intestinaltraktes stellt eine Barriere gegen Noxen und Antigene des Darmlumens dar. Kommt es zu Epithelschäden, wird die epitheliale Barriere durch spezielle Reparaturmechanismen wieder hergestellt. Den ersten Schritt stellt hierbei die Restitution dar, bei der wundnahe Epithelzellen in den Zelldefekt einwandern, um die Wunde abzudecken. Zur vollständigen Regeneration des Gewebes setzt anschließend eine Zellproliferation und -differenzierung ein. Verschiedene Zytokine und Wachstumsfaktoren nehmen Einfluss auf die Wundheilung von geschädigtem Darmepithel. Die bei einer HIV-Infektion symptomatisch auftretende HIV- Enteropathie ist histologisch durch fokale Zelldegenerationen der Darmschleimhaut gekennzeichnet. In Darmbiopsaten von HIV-infizierten Patienten werden erhöhte Zytokin-konzentrationen nachgewiesen. Es wurde auch bereits gezeigt, dass die im Überstand von HIV-infizierten Immunzellen detektierten Zytokine (TNF-a, IL-1ß, IFN-y, IFN-a) die Barrierefunktion von intestinalen HT-29/B6-Zellen beeinträchtigen. Offen bleibt die Frage, ob neben der Zytokin- bedingten Zellschädigung auch eine verlangsamte Restitution zum Barrieredefekt beiträgt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der Einfluss von HIV- typischen Zytokinen auf die Restitutions-geschwindigkeit von intestinalen Epithelzellen untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die eine genauere Bestim-mung der Restitutionsgeschwindigkeit erlaubt als frühere Verfahren. HT-29/B6-Monolayer wurden einen Tag mit Zytokinen vorinkubiert. Mit einem speziellen Versuchsaufbau wurde eine definierte Fläche aus dem Zellrasen geschnitten. Nach einer 2-stündigen Inkubation wurde fixiert und immunhistologisch gegen die Tight junction- Proteine ZO-1 und Occludin gefärbt. Dadurch konnte der erzeugte Zelldefekt mittels Epifluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Durch Ausmessung der Defektes vor und nach 2-stündiger Restitution konnte die Restitutionsgeschwindigkeit berechnet werden. Es ist bekannt, dass EGF und TGF-ß1 die epitheliale Restitution positiv beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit konnte nach deren Applikation ebenfalls eine Erhöhung der Migrationsgeschwindigkeit festgestellt werden. Das proinflammatorische Zytokin TNF-a, das bei Immunreaktionen und Entzündungsprozessen eine zentrale Rolle spielt, veränderte die Restitutionsgeschwindigkeit von HT-29/B6-Zellen dagegen nicht. Das proinflammatorisch wirkende IL-13 führte zu einer Abnahme der Restitutions-geschwindigkeit. Dieses Ergebnis könnte im Hinblick auf die chronisch entzündliche Darmerkrankung Colitis ulcerosa von zentraler Bedeutung sein, da bei einer experimentellen, durch Oxazolon ausgelösten Colitis, die histologisch mit Colitis ulcerosa vergleichbar ist, eine erhöhte Produktion von IL-13 stattfindet. Bei HIV-Infektion typischerweise im Darm nachgewiesene Zytokine wurden im Restitutionsexperiment zunächst einzeln getestet. Sowohl IFN-y als auch IFN-a, übten keinen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Restitution aus. Das zu den proinflammatorischen Zytokinen zählende IL-1ß beschleunigte die Restitution, ebenso die Kombination von TNF-a und IFN-y. Abschließend wurden HIV-typische Zytokine (TNF-a, IL-1ß, IFN-y, IFN-a) in Kombination in der von HIV-infizierten Immunzellen erzeugten Konzentration eingesetzt. Diese führten zu einer Erhöhung der Restitutionsgeschwindigkeit. Es ließ sich somit feststellen, dass die HIV-typische Zytokinmischung die intestinale epitheliale Restitution beschleunigt und so der gleichzeitig bewirkten Zellschädigung entgegenwirkt.

The mucosal epithelium of the alimentary tract represents a barrier to noxious and immunogenic substances within the intestinal lumen. Damage of the epithelial surface which is seen both, under physiological condition and in certain patho-physiological changes, like inflammatory bowel disease or bacterial infections. Resealing of the mucosal epithelium is accomplished by epithelial cell migration, termed restitution, cell proliferation and differentiation. Repair of the intestinal surface epithelium is regulated by various cytokines and growth factors. HIV enteropathy, which is often seen in HIV-infected patients, is histologically described by focal cell degeneration. Increased levels of cytokines are found in intestinal biopsies of HIV-infected patients. From previous studies it is known that HIV infection of immune cells leads to increased cytokine production (TNF-a, IL-1ß, IFN-y, IFN-a). Furthermore it is shown that this specific cytokine pattern alters barrier function in intestinal HT-29/B6 cells. Apart from cytokine induced barrier defects nothing is know about the modulation of epithelial restitution. For the first time this work addressed the question which kind of effects HIV- typical cytokines have on epithelial restitution. In the present study a new method was developed, which allows a more exact measurement of the velocity of restitution than previous methods. HT-29/B6 monolayers were incubated with cytokines for one day. Thereafter, a defined area of the monolayer was cut out. Two hours later the epithelium was fixed and stained using ZO-1 and occludin antibodies to visualize the tight junctions. The extent to which the gap was closed was measured and from that the velocity of restitution was determined. From several studies it is known that EGF and TGF-ß1 stimulate intestinal epithelial cell restitution. In the present report application of this cytokines promoted the velocity of restitution. TNF-a, a central mediator in immune response and inflammation, did not alter the restitution of HT-29/B6 cells. The recently characterized pro-inflammatory cytokine IL-13, which is the key cytokine in an experimental model of ulcerative colitis, inhibited intestinal cell migration. This effect might contribute to the epithelial barrier dysfunction seen in ulcerative colitis. The cytokine production in the intestinal mucosa of HIV patients is altered. These HIV-typical cytokines were tested in the restitution experiment. IFN-y as well as IFN-a did not alter the velocity of cell migration. IL-1ß, a proinflammatory cytokine, stimulated the restitution, and the same did the combination of TNF-a and IFN-y. Finally, the combination of HIV-typical cytokines (TNF-a, IL-1ß, IFN-y, IFN-a) was applied at a concentration found to be produced by HIV-infected immune cells. They enhanced the velocity of the epithelial restitution. In summary, these results indicate that the combination of HIV-typical cytokines stimulate the intestinal epithelial restitution and thereby counteract their destructive effect on mucosal epithelium.