Colorectal cancer (CRC) is the third most common malignant neoplasm and a major cause of cancer mortality worldwide. It is known that microRNAs play a critical role in oncogenic signaling pathways, including oncogenesis, progression, invasion, metastasis and angiogenesis. Previous studies of microRNA expression patterns in CRC elucidated a strong association between expression levels of microRNAs and the tumor stage as well as the survival prognosis for cancer patients. To investigate the microRNA expression patterns in a global scale we performed microRNA expression analyses with Illumina next generation sequencing technologies. We sequenced smallRNAs of eight colon cancer patients, each with matching normal, tumor and metastasis tissues from the same patient and analyzed in addition the microRNA expression in colon cancer cell lines SW480 and their corresponding metastasis cell line SW620. We found new and already known microRNAs, and validated different expression patterns using TaqMan assay technologies. We found that an identified signature of two microRNAs, miR-1 and miR-135b, suffice in combination to completely discriminate tumor from normal colorectal mucosa. We extended our screen to 330 additional tumor and normal tissue samples and were able to confirm these microRNAs as potential biomarkers in tumors. The most promising candidate we identified, miR-1, showed a significantly reduced expression in primary colon tumor and metastasis and was constantly down-regulated over 16 additional tumor entities. This microRNA is reported to target and inhibit c-Met (met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor)) in rhabdomyosarcoma and it is also known as down-regulated in primary lung cancer tissues and cell lines. Based on these findings and on the results of our expression analyses we could demonstrate an effect of miR-1 overexpression on cell viability and on wound healing behavior in colon cancer cells. The functional analyses showed a tumor suppressive activity of miR-1 in the advancement of CRC. Using target prediction algorithms, such as TargetScan and PicTar, we identified PTPLAD1 (protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 1) as target and showed a direct regulation through miR-1 through GFP reporter assay. Additionally, the influence on the chemosensitivity of CRC cells towards camptothecin in response to a miR-1 overexpression was investigated, and a synergistic effect was shown in colon cancer cell lines. Within further studies we used PyBioS, a systems-biology simulation of cellular cancer models, to examine miR-1 function and the effects of a miR-1 depletion as well as overexpression as a potential therapeutic option. For our colon cancer patients we showed that a combination of deep sequencing data and a systems biological modeling of microRNA drug treatment could be a promising tool to realize new strategies for personalized cancer therapy, where a patient-specific prognosis could be possible. In this study not only known microRNAs were analyzed using next generation sequencing. In addition, we were able to identify and validate not yet annotated microRNAs. Using Northern Blot analyses we proofed the existence of a novel microRNA localized on chromosome 17 (chr17:70256349-70256434) with a predicted secondary structure that underlines the integrity of this novel microRNA. As an additional characteristic for colon cancer progression we investigated mutations in microRNA regions, whereas the identified unknown variations localized in miR- 663b and miR-1324 were determined as somatic mutations. Based on the whole exome re-sequencing data we analyzed mutation rates in microsatellite instable (MSI) and stable (MSS) colon cancer patients. Applying two different re- sequencing technologies, microarray-based-genomic selection technology and a multiplex exon capturing approach, we observed a higher mutation rate in MSI colon cancer patients. In conclusion, this work emphasized the critical role of microRNAs in the pathogenesis of colorectal cancer and underlines the significance of microRNAs in the development of new strategies for individualized cancer treatment. This approach could facilitate the identification of novel diagnostic and prognostic biomarkers, but also for the design of new therapeutic molecules.
Kolorektale Karzinome gehören zu den dritthäufigsten malignen Neoplasmen und zählen weltweit zu der häufigsten Todesursache. Es ist bekannt, dass microRNAs eine entscheidende Rolle in Signalwegen, wie der Onkogenese, Tumorprogression und -invasion, sowie der Metastasierung und Angiogenese spielen. Frühere Studien von microRNA-Expressionsmustern im kolorektalen Karzinom zeigten einen engen Zusammenhang zwischen den Expressionsintesitäten von microRNAs und dem Tumorstadium sowie der Überlebensprognose von Krebspatienten. Um microRNA- Expressionsmuster im globalen Maßstab zu untersuchen, führten wir microRNA- Expressionsanalysen unter Anwendung der Illumina „Next-Generation“ Sequenzierungstechnologie (NGS) durch. Wir sequenzierten die „smallRNA“ Fraktion von acht Darmkrebspatienten, dabei von jedem Patienten jeweils Normal-, Tumor- und Metastasengewebe. Zusätzlich wurde die microRNA-Expression in der Darmkrebszelllinie SW480 und ihrer entsprechenden Metastasenzelllinie SW620 von uns analysiert. Hierbei fanden wir neue als auch bereits bekannte microRNAs und validierten verschiedene Expressionsmuster unter Verwendung der „TaqMan Assay“ Technologie. Eine von uns identifizierte Expressionssignatur von zwei microRNAs, miR-1 und miR-135b, genügte, um eine vollständige Auftrennung des Tumorgewebes von der normalen kolorektalen Schleimhaut zu erreichen. Wir erweiterten unsere Untersuchungen auf 330 zusätzliche Tumor- und Normalgewebeproben und waren in der Lage, die erwähnten microRNAs als potentielle Biomarker für Tumore zu bestätigen. Der vielversprechendste von uns identifizierte Kandidat, miR-1, zeigte eine signifikant reduzierte Expression im primären Darmkarzinom und in Metastasen, ebenso war miR-1 in 16 zusätzlichen Tumorentitäten konstant herunterreguliert. Diese microRNA interagiert und inhibiert das Onkogen c-Met (met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor)) im Rhabdomyosarkom, und ist ebenfalls im primären Lungenkarzinomgewebe als auch in Lungenkarzinomzelllinien herunterreguliert. Basierend auf diesen Forschungsergebnissen und anhand der von uns aus Expressionsanalysen erhaltenen Resultate, konnten wir einen Effekt auf die Zellviabilität und das Wundheilungsverhalten von miR-1-überexpremierenden Darmkarzinomzellen demonstrieren. Funktionelle Analysen zeigten eine tumorsuppressive Aktivität von miR-1 im Hinblick auf die fortschreitende Entwicklung eines kolorektalen Karzinoms. Unter Anwendung von Vorhersagealgorithmen, wie TargetScan und PicTar, identifizierten wir verschiedene miR-1 Targetgene und selektionierten PTPLAD1 (protein tyrosine phosphatase-like A domain containing 1), VEGFA (vascular endothelial growth factor A), PDGFA (platelet-derived growth factor alpha polypeptide) und HIF1A (hypoxia inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor)) für weiterführende GFP-Reporterassays, in deren Verlauf wir eine direkte Regulation von PTPLAD1 durch miR-1 beweisen konnten. Darüber hinaus untersuchten wir den Einfluss auf die Chemosensitivität in kolorektalen Karzinomzellen gegenüber Champtothecin als Antwort auf eine miR-1 Überexpression und konnten einen synergistischen Effekt in Darmkrebszelllinien nachweisen. In weiterführenden Analysen verwendeten wir PyBioS, ein systembiologisches Simulationsprogramm, das auf zellulären Krebsmodellen basiert, um miR-1 als mögliche Therapieoption zu untersuchen. Für die von uns untersuchten Darmkrebspatienten konnten wir zeigen, dass eine Kombination von Sequenzierungsdaten und einer systembiologischen Modellierung der microRNA- bezogenen Arzneimitteltherapie ein vielversprechendes Hilfsmittel darstellt, um neue Strategien in der personalisierten Krebstherapie zu realisieren. Die Erstellung patientenspezifischer Prognosen könnte dadurch erreicht werden. In dieser Studie konnten nicht nur bereits bekannte microRNAs mit Hilfe der Next- Generation-Sequenzierungstechnologie analysiert, sondern auch unbekannte microRNAs identifiziert und validiert werden. Unter Anwendung von Northern Blot Analysen war es möglich, die Existenz einer neuen microRNA zu beweisen, die auf Chromosom 17 (chr17:70256349-70256434) lokalisiert ist und deren prognostizierte Sekundär-Struktur ebenfalls die Integrität der neu identifizierten microRNA unterstreicht. Als eine weitere mögliche Ursache der Darmkrebsentwicklung untersuchten wir Mutationen in microRNA-Regionen, wobei die identifizierten und noch nicht annotierten Variationen, lokalisiert in miR-663b und miR-1324, als somatische Mutationen bestimmt wurden. Im Rahmen der Mutationsanalysen konnten wir auch zeigen, dass die Mutationsrate in mikrosatelliten-instabilen (MSI) Darmtumoren im Gegensatz zu mikrosatelliten- stabilen (MSS) signifikant erhöht sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit die entscheidende Rolle von microRNAs in der Pathogenese des kolorektalen Karzinoms hervorhebt, und die Signifikanz von microRNAs in der Entwicklung neuer Strategien für die individualisierte Krebstherapie unterstreicht, in der microRNAs sowohl als neue diagnostische und prognostische, aber auch als potentielle neue therapeutische Wirkstoffe fungieren können.
