Die Vereinfachung des Nachweises des Kapsel- und Toxinplasmids von Bacillus anthracis aus Bodenproben

Abstract

Der Nachweis von Milzbrandsporen aus der Umwelt war bisher nur mit einer konventionellen nested PCR möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wird ein PCR- ELISA entwickelt, der in verschiedenen Variationen als gebrauchsfertiger Kit gestaltet werden kann. Die PCR basiert auf aus der Literatur bekannten Primer- Paaren, die an Sequenzmotive der Plasmide pXO1 und pXO2 sowie an die chromosomale DNA binden. Für den ELISA werden zwei grundlegende Methoden erarbeitet, wovon die eine auf dem kommerziell erhältlichen PCR Dig Detection Kit der Fa. Boehringer basiert, die andere eine Beschichtung der Mikrotestplatten direkt mit den Fängersonden, über die Ausbildung von Phosphoamididbindungen, verwendet. Die Denaturierung der DNA erfolgt chemisch mittels NaOH, die Hybridisierung an die Sonden und die Immobilisierung an die Platten geschieht in einem Arbeitsschritt. Bei beiden Methoden wird das Amplicon (PCR Produkt)mittels Digoxigenin- 11- dUTP während der PCR markiert. Die Detektion der Markierung erfolgt in einem ELISA mittels AP oder POD markierter Antikörper gegen Digoxigenin. Routinemäßig wird die Anwendung eines colorimetrischen Nachweises empfohlen. Um den Anwendungsbereich des Tests zu erweitern werden jedoch auch Lumineszenz- und Fluoreszenzsubstrate getestet sowie ein Enhancement- System zur Signalverstärkung. Mit der Basis- Methode ist es möglich, vier Milzbrandsporen aus 100 g Erde nachzuweisen. Die Ergebnisse der Untersuchung von mehr als 500 Umweltproben entweder mit der konventionellen nested PCR oder dem PCR ELISA zeigen, daß falsch positive Reaktionen, insbesondere bei mikrobiologisch hochaktiven Böden, erwartet werden müssen. Es kann nachgewiesen werden, daß die von PATRA et al (1996)beschriebenen Primer für das Chromosom von Bacillus anthracis auch mit Stämmen von Bacillus cereus reagieren. Verschiedene publizierte Primer für das Plasmid pXO2 führen zu falsch- positiven Ergebnissen in einzelnen Erdproben. Die DNA Sequenzierung der falsch positiven PCR Produkte zeigen ausreichend viele Unterschiede zur Sequenz von Bacillus anthradis, um die Existenz von zumindest einem weiteren Organismus mit hoher Ähnlichkeit zu den Sequenzen des Plasmids pXO2 von Bacillus anthracis vorherzusagen.

In this study several ways of designing a PCR ELISA for the sensitive detection of Bacillus anthracis are elaborated and compared to each other. The PCR itself is based on pairs of primers which are described by several authors in the literature targeting sequences of the pXO1 and pXO2 plasmids as well as genomic DNA. Two basic procedures are worked out, fromwhich one is based on a commercially available kit (PCR Dig Detection Kit, Boehringer) and the other on the technique described by RASMUSSEN et al. (1991) which is based on forming of a covalent phosphoamide- binding between a Covalink plate coated with free amino groups and the 5`phosphate group of the chemically labeled DNA of the so called catching probe. Denaturation of DNA is done chemically by NaOH before filling the mixture into the wells of the plate, where hybridization and immobilisation are carried out in one working step. In both techniques the target DNA is labeled with digoxigenine- 11- dUTP during the PCR- step. The detection of labeled DNA fixed by hybridization to the plate bound so called catching probe is done by ELISA based on alkaline phosphatase or peroxidase labeled antibodies to digoxigenine. Generally it is recommended to use colorimetric measurement. In order to expand the usefulness of the test, luminescent and fluorescent substrates are investigated too as well as several enhancement systems for the detection signal. With the basic method four spores of Bacillus anthracis can be detected in 100 g of soil. Results from the investigation of more than 500 environmental samples with either the conventional nested PCR or the PCR ELISA showed that false- positive reactions may occur especially with samples from the microbiologic active layers of the soil. The primers described by PATRA et al. (1996) are detedting som strains of Bacillus cereus, too. Sets of primers described for pXO2 plasmid give false positive results in some soils. DNA sequencing of the false positive PCR products showed sufficient differences to predict the existence of at least one different strain with high similarity to Bacillus anthracis within the capsule encoding gene.