EXPRESSION PROFILING IN THE HEART FAILURE RAT MODEL SHHF AND ANALYSIS OF THE MOLECULAR BASIS AND FUNCTION FOR THE CANDIDATE GENE Cd36

Abstract

Heart failure describes the inability of the heart to pump enough blood to fulfill the needs of the body. In order to investigate the etiology and molecular events underlying the disease, the expression profiling of the spontaneously hypertensive heart failure rat (SHHF) compared with nonfailure controls were investigated. SHHF is a genetically inbred strain that have many similarities to the human disease for it slowly develops hypertension, hyperinsulinemia, diabetes mellitus, and heart failure. The spontaneously hypertensive rat stroke prone (SHRSP) serve as the control strain for its hypertension background, and the Wistar Kyoto rat (WKY) as the normotensive control. The candidate genes selected from Affymetrix chips analysis could be clustered into 9 groups according their functions. The genes of collagen type I and III, thrombospondin 4, heat shock 70, cyclin D, and cysteine rich protein showed consistent changes in the SHHF with previous studies of heart failure. In particular, the genes involved in fatty acid metabolism e.g. Cd36, and pyruvate dehydrogenate kinase 4 were downregulated, and genes related to glucose metabolism such as fructose bisphosphatase 2, uncoupling protein 1, and retinoid X receptor were upregulated in the SHHF compared with the two controls. Protein tyrosine phosphatase and PS20 were also found increase in SHHF strain. These changes were further confirmed with the quantitative Real Time PCR. Cd36, a heavily glycosylated integral membrane protein, is implicated in the binding to long-chain fatty acids and oxidized low-density lipoprotein, its deficiency leads to severe decrease in fatty acid uptake in the tissues active in fatty acid metabolism. Cd36 deficiency has also been linked to insulin resistance, cardiac hypertrophy, and tolerance to ischaemia in rodent models with a diversity of heart disease. Cd36 was found downregulation in the SHHF compared with WKY and SHRSP by expression profiling and Real Time PCR in this study. The normal transcript of CD36 was not observed in SHHF animals, whereas two novel extended transcripts of Cd36 were found. The full lengths of the cDNA sequences were acquired. The gene Cd36 has three and a half homologues in the normal rat chromosome 4. While on the SHHF rat genome, about 164.68 kb fragments were deleted between the intron 4 of the first copy and the last homologues of Cd36 gene. From these results, it is suggested that the abnormal transcription of Cd36 in SHHF may result in the nonfunctional product, or obviously lower translation of Cd36. To further investigate the link between Cd36 and heart failure in SHHF model a linkage analysis of Cd36 to heart failure was performed using HinfI RFLP along with three markers on either side of Cd36 in (SHHF×WKY) F2 crosses (n=191). The calculated hemodynamic parameters were used as the indicators in response to heart failure. The locus on chromosome 4q11-12 showing suggestive linkage to heart failure that was determined from the cardiac output parameter in F2 male rats.

Herzinsuffizienz beschreibt einen Zustand der unzureichenden Funktion des Herzens. Das Herz ist nicht mehr in der Lage eine den Anforderungen des Körpers entsprechende Pumpleistung zu erbringen. Um die Ätiologie und die molekularen Ereignisse zu untersuchen, die der Herzinsuffiziens zugrunde liegen, wurden die Expressionsprofile der Spontan-Hypertensiven- Herzinsuffiziens-Ratte (SHHF) mit Kontrollratten verglichen. Die SHHF-Ratte ist ein genetischer Inzuchtstamm, dessen Krankheitsbild starke Gemeinsamkeiten zur menschlichen Erkrankung aufweist, wie die langsame Entwicklung von Bluthochdruck, Hyperinsulinämie, Diabetes mellitus und Herzinsuffizienz. Die Spontan-Hypertensive-Ratte mit Neigung zum Schlaganfall (SHRSP) diente mit ihrem Hypertonie-Hintergrund als Bluthochdruck-Kontrollstamm. Der Stamm Wistar-Kyoto-Ratte (WKY) wurde als normotensive Kontrolle herangezogen. Kandidatengene, die mit Hilfe von Affymetrix-Chip�Analysen ausgewählt wurden, konnten entsprechend ihrer Funktion in 9 Gruppen zusammengefaßt werden. Die Gene des Kollagens Typ I und III, Thrombospondin 4, Heat shock 70, Cyclin D und CRP (cysteine rich protein) zeigten in der SHHF-Ratte Veränderungen, die konsistent mit Ergebnissen aus früheren Studien zum Herzversagen sind. Im Besonderen waren Gene, die in den Fettstoffwechsel involviert sind, wie z.B. Cd36 und Pyruvatdehydrogenatkinase 4, herunter reguliert. Gene, die in den Metabolismus von Glukose involviert sind, wie Fruktosebiphosphatase 2, Uncoupling Protein 1 und der Retinoid X-Rezeptor, waren in der SHHF-Ratte, im Gegensatz zu den zwei Kontrollen, hoch reguliert. Weiterhin wurde in der SHHF- Ratte eine Erhöhung der Genregulation bei der Proteintyrosinphosphatase und bei PS20 festgestellt. Diese Veränderungen wurden anschließend mit einer quantitativen Realtime-PCR bestätigt. Cd36, ein stark glykosyliertes, integrales Membranprotein, ist beteiligt bei der Bindung langkettiger Fettsäuren und oxidiertem Low-Density-Protein; ein Mangel führt zu einer stark verminderten Aufnahme von Fettsäuren in den am Fettstoffwechsel beteiligten Geweben. Ein Cd36-Defizit in Nagetiermodellen für verschiedene Herzerkrankungen konnte des weiteren mit Insulinresistenz, Herzhypertrophie und Ischämie-Toleranz in Verbindung gebracht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe von Expressionsanalysen und Realtime-PCR bewiesen, daß die Expression von Cd36 im SHHF-Stamm, verglichen mit WKY- und SHRSP-Ratten, herunter reguliert ist. Das normale Transkript von Cd36 konnte in SHHF-Tieren nicht nachgewiesen werden. Statt dessen wurden zwei verlängerte Transkripte entdeckt, deren komplette cDNA gewonnen wurde. Im regulären Rattenchromosom 4 befinden sich 3½ homologe Cd36-Gene. Im SHHF-Chromosom 4 fehlen dagegen 164,68 kb zwischen dem Intron 4 des ersten Kopie und dem letzten Homologen. Diese Ergebnisse implizieren, daß die anormale Transkription von Cd36 in SHHF möglicherweise zu einem nicht funktionsfähigen Produkt führt, oder eine verminderte Translation erfolgt. Um die Verbindung zwischen Cd36 und der Herzinsuffizienz im SHHF-Modell zu analysieren, wurde eine RFLP-Analyse mit drei Cd36 benachbarten Markern in F2-Generationen (n=191) einer (SHHFxWKY)-Kreuzung durchgeführt. Die erhaltenen hämodynamischen Parameter wurden als Indikatoren für Herzversagen herangezogen. Der Locus auf Chromosom 4q11-12 wies eine signifikante Kopplung zur Herzinsuffizienz auf, die in männlichen Ratten über das Herzzeitvolumen festgestellt wurde.