Proteomische, biochemische und biophysikalische Untersuchungen zu phosphorylierungsabhängigen Interaktionen des Immunzellproteins ADAP

Abstract

T-Zellen gehören zu den Hauptakteuren der zellvermittelten Immunität. Ihre besondere Fähigkeit zur Migration und Adhäsion ist entscheidend für die Auslösung einer Immunantwort. Änderungen der Adhäsions- und Migrationseigenschaften von T-Zellen werden über die stimulationsabhängige Aktivierung von Adhäsionsmolekülen, den Integrinen, vermittelt. Das Adapterprotein ADAP ist ein zentraler Bestandteil eines größeren Proteinkomplexes, der sich stimulationsabhängig assembliert und so die Affinität und Avidität von Integrinen reguliert. In seiner Funktion als Adapterprotein wird ADAP an mehreren Tyrosinresten phosphoryliert und vermittelt hierüber zahlreiche Interaktionen wie beispielsweise mit den Adapterproteinen SLP76 und NCK sowie der Tyrosinkinase FYN. In der vorliegenden Arbeit konnten erstmals alle FYN-abhängigen Tyrosin- Phosphorylierungsstellen von ADAP systematisch und zeitabhängig charakterisiert werden. Hierunter befanden sich die Tyrosinreste 462 und 571, für die bisher keine Interaktionspartner bekannt waren. Der Tyrosinrest 571 wurde darüber hinaus in zahlreichen unabhängigen phosphoproteomischen Studien identifiziert. Mit Hilfe von SILAC-basierten Pulldown-Experimenten in Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie konnten potentielle Interaktionspartner der phosphorylierten Tyrosinreste 462 und 571 ermittelt werden, wobei synthetische Peptidsequenzen als Köder verwendet wurden. Da sich die Position Y571 am Rand der strukturierten hSH3N-Domäne von ADAP befindet, wurden zudem rekombinant hergestellte und in vitro phosphorylierte Proteinkonstrukte als Köder eingesetzt. Interessanterweise konnte die Tyrosinkinase ZAP70 als neuer Interaktionspartner der Y571-phosphorylierten hSH3N-Domäne identifiziert werden. Mit Hilfe von NMR- und MST-Untersuchungen konnte eine direkte, phosphorylierungsabhängige Interaktion der hSH3N-Domäne mit der N-terminalen SH2-Domäne von ZAP70 bestätigt werden (KD = 2,3 μM). Darüber hinaus konnte in funktionellen Studien mit Jurkat T-Zellen gezeigt werden, dass der Tyrosinrest 571 in ADAP selektiv an der chemokinvermittelten gerichteten Migration sowie der Aktin-Polymerisation beteiligt ist, während kein Einfluss auf die zelluläre Adhäsion und Konjugatbildung mit APCs beobachtet wurde. Eine Entfernung von ADAP zeigte erwartungsgemäß Defekte sowohl der Migration als auch der Adhäsion, so dass mit dem Tyrosinrest Y571 eine kritische Determinante zur Unterscheidung dieser unterschiedlichen Funktionalitäten von ADAP identifiziert werden konnte. Die Identifizierung niedrig abundanter Bindungspartner in AP-MS-Experimenten wird durch den hohen Überschuss des Köderproteins in der Präparation erschwert. Im zweiten, methodisch orientierten Teil dieser Arbeit konnte ein einfaches und robustes Verfahren zur kovalenten und gerichteten Immobilisierung von synthetischen Peptiden sowie rekombinant hergestellten Proteinen mittels Sortase A entwickelt werden. Das Verfahren wurde erfolgreich in Peptid- und Protein- basierten Pulldown-Experimenten eingesetzt.

T cells play a major role in cell-mediated immunity. Their ability to initiate an immune response depends on their capability to change their adhesive and migratory properties in response to an extracellular stimulus. Signal transduction from activated receptors to adhesion molecules known as integrins is mediated by a receptor-proximal signalling complex that contains the adapter protein ADAP as a central constituent. Upon stimulation, ADAP is phosphorylated on several tyrosine residues, which then serve as docking sites for SH2-domain containing proteins like the adapters SLP76 and NCK, as well as the tyrosine kinase FYN. In this study, ADAP was phosphorylated by FYN kinase in vitro in order to undertake a comprehensive analysis of tyrosine- phosphorylation sites by mass spectrometry. The tyrosine residues 462 and 571 were among the most heavily phosphorylated positions, yet, prior to this study, no interaction partners were known for these positions. Interestingly, ADAP-Y571 was also identified by independent phosphoproteomic studies. Using SILAC-based pulldown experiments with short synthetic peptide baits in combination with quantitative mass spectrometry, several novel potential interaction partners were identified. Since ADAP-Y571 is located at the border of the ADAP-hSH3N-domain, additional pulldown experiments were performed using recombinant and in vitro-phosphorylated protein constructs as baits. Surprisingly, the tyrosine kinase ZAP70 could be reproducibly identified as a specific interaction partner of Y571-phosphorylated ADAP-hSH3N-domain, but not in the context of the unstructured peptide sequence. NMR spectroscopy and MST measurements were used to confirm a direct and phosphorylation-dependent interaction between the phosphorylated hSH3N-domain of ADAP and the N-terminal SH2-domain of ZAP70 (KD = 2,3 μM). In functional assays with Jurkat T cells, ADAP-Y571 was shown to selectively affect chemokine-mediated migration and actin polymerisation, while no influence was observed for adhesion and conjugate formation with antigen presenting cells. In contrast, the depletion of full-length ADAP led to impaired adhesion and migration. Therefore, ADAP-Y571 was identified as a critical determinant for distinguishing the different functionalities of ADAP. In classical AP-MS methods, the identification of low-abundance interaction partners is often hampered by dominant peptide signals of the bait protein in the analyte solution. To overcome this inherent problem, an efficient and robust method for covalent and site-specific immobilization of synthetic peptides or recombinantly expressed proteins was developed using the transpeptidase sortase A. Subsequently, this new “sortase approach” was successfully utilized for investigating phosphorylation-dependent peptide-protein interactions of ADAP and PRS-mediated protein-protein interactions of the CD2BP2-GYF-domain.