dc.contributor.author
Richter, Karin Birgit
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:34:40Z
dc.date.available
2011-01-20T13:35:19.446Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5197
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9396
dc.description.abstract
Die Endozytierung synaptischer Vesikel-Proteine von der Plasmamembran zurück
in synaptische Vesikel ist ein streng regulierter Prozess. Bisher wurde davon
ausgegangen, dass sich der Sortierungsprozess für alle synaptischen Vesikel-
Proteine ähnelt. Allerdings existieren Hinweise, die auf eine spezielle
Sortierung von vesikulären Glutamattransportern (VGluts) hindeuten. Diese
Sortierung ist jedoch weitestgehend unverstanden. Es scheint, dass VGlut1 und
2 nicht nur während der Endozytose an die Plasmamembran sortieren, sondern
(tageszeitabhängig) gezielt dorthin transportiert werden. Fraglich ist, ob sie
an der Plasmamembran funktionell (z.B. als Natrium-Phosphat-Transporter)
ebenfalls relevant sind und ob ein Funktionswechsel eine Rolle in der
neuronalen Transmission spielt. In dieser Arbeit wurde der Sortierungsprozess
von VGlut1 und 2 in verschiedenen zellulären und subzellulären Systemen
untersucht und die Bedeutung von Interaktionspartnern für die Regulation von
VGlut1 und 2 betrachtet. Hierfür wurden unter anderem GST-Bindungsstudien mit
Mäusegehirnfraktionen, Neurotransmitter-aufnahmeversuche und konfokale
Mikroskopie eingesetzt. Die Untersuchung der Translokation von VGlut zwischen
Plasma- und synaptischer Vesikelmembran wurde über zwei Wege bearbeitet.
Erstens zeigten GST-Bindungsstudien mit GST-Fusionsprotein, bestehend aus GST
und der SH3-Domäne von Endophilin bzw. dem C-Terminus von VGlut1 und 2, dass
nur VGlut1 an Endophilin bindet, nicht jedoch VGlut2. VGlut2 hingegen bindet
direkt an den Adapterproteinkomplex AP2, was auf individuelle
Sortierungsprozesse in den jeweiligen VGlut-Neuronen hinweist. Neueste Studien
zeigten eine Kolokalisation von VGlut1 und 2 in ein und demselben Neuron.
Neurone, die sowohl VGlut1 als auch VGlut2 tragen, könnten über die
individuelle Sortierung nicht nur unterschiedliche VGlut1 und 2-Vesikelpools
generieren. Ebenfalls ist denkbar, dass eine spezifische Sortierung eines der
Transporter z.B. an die Plasmamembran möglich ist, während der andere
Transporter z.B. auf dem Vesikel „gelagert“ wird. VGlut1 (und VGlut2) zeigt
ein zirkadianes Sortierungsverhalten und lokalisiert in Abhängigkeit der
Tageszeit zwischen Plasma- und Vesikelmembran. Um zu prüfen, ob der
zirkadianen Oszillation der vesikulären VGlut1-Mengen eine ebenfalls
oszillierende Interaktion von VGlut1 mit Endophilin zugrunde liegt, fanden
zweitens in dieser Arbeit Untersuchungen an Mäusen statt, die in einem 12h
Licht/12h Dunkel- oder 12h Dunkel/12h Dunkelzyklus gehalten wurden. Mit Hilfe
von GST-Fusionsprotein, bestehend aus GST und der SH3-Domäne von Endophilin,
konnte in WT-Mäusen eine oszillierende Bindung von VGlut1/Dynamin in
Abhängigkeit der Tageszeit an Endophilin festgestellt werden. Die Deletion des
Uhrengens Period 2 in Per2BRDM1-Mäusen veränderte die Rhythmizität der Mäuse,
was sich in einer gleichbleibenden Bindefähigkeit von VGlut1 (bezogen auf
Dynamin) an GST-SH3-Endophilin zeigte. Damit wird deutlich, dass VGlut1 anders
als andere synaptische Vesikel-Proteine individuell sortiert wird und diese
Sortierung nicht nur im Zuge der Endo- bzw. Exozytose eine Rolle spielt. Als
Modell für die VGlut2-Translokation wurde eine VGlut2-exprimierende
Phäochromozytomzelllinie der Ratte (PC12) charakterisiert. In diesen Zellen
kommt der Transporter vornehmlich an der Plasmamembran vor. Nur VGlut2- und
nicht pcDNA3-transfizierte PC12-Zellen zeigen in Gegenwart von Phosphat eine
unmittelbare Natriumaufnahme über die Plasmamembran. VGlut2 wirkt in diesen
Zellen also eher als Natrium-Phosphat-Co-transporter und weniger als
vesikulärer Glutamattransporter, was auf eine funktionelle Relevanz in
Abhängigkeit der Sortierung deutet. Zusammenfassend kann festgestellt werden:
1) Während VGlut1 mit Endophilin interagiert, bindet VGlut2 direkt den
Adapterproteinkomplex AP2. 2) Die Bindung von VGlut1 an Endophilin unterliegt
einer tageszeitabhängigen Regulierung. 3) VGlut2 besitzt in transfizierten
PC12-Zellen die Funktion eines Natrium-Phosphat-Transporters.
de
dc.description.abstract
The Endocytosis of synaptic vesicle proteins from the plasma membrane back
into synaptic vesicles is a highly regulated process. Until now research
assumed the trafficking process of synaptic vesicle proteins to be similar.
Data exists, however, indicating that the trafficking of vesicular glutamate
transporters (VGluts) differs even though it is still poorly understood. It
seems that VGlut1 and 2 sort to the plasma membrane not only during
exocytosis, but are also transported there in a specific day time dependent
manner. Questions remain, such as whether VGlut1 and 2 are functionally
relevant at the plasma membrane, e.g. as a sodium phosphate transporter, and
whether this change in function is important for synaptic transmission. In
this thesis, the trafficking of VGlut1 and 2 in different cellular and
subcellular compartments was investigated as well as the impact of interaction
partners for the regulation of VGlut1 and 2 using GST pulldown assays with
mouse brain extract, neurotransmitter uptake assays and confocal microscopy.
This study approaches the translocation of VGlut to the plasma membrane in two
different ways. Firstly, GST pulldown assays using GST fusion proteins with
GST and the SH3 domain of Endophilin or, accordingly, the C-Terminus of VGlut1
and 2, showed an interaction of Endophilin and VGlut1 but not for VGlut2.
VGlut2 interacts directly with the adapter protein complex AP2 indicating
individual trafficking routes for VGluts. The latest data reveals the
coexistence of VGlut1 and 2 in the same neuron. Neurons carrying VGlut1 and 2
might not only generate different vesicle pools; it is further possible that
one transporter is sorted to the plasma membrane leaving the other on the
synaptic vesicle. VGlut1 (and VGlut2) harbours a circadian trafficking pattern
and cycles in a day time dependent manner between plasma and vesicle membrane.
Secondly, in order to investigate whether an oscillating binding of VGlut1 to
Endophilin forms the basis of the circadian oscillation in the amount of
vesicular VGlut1, brain extracts of mice entrained in a 12h light/12h dark-
cycle or 12h dark/12h dark-cycle were analysed by GST pulldown assays. The
analysis of wild type mice using GST fusion protein containing GST and the SH3
domain of Endophilin, showed an oscillating binding pattern of VGlut1 (in
ratio to Dynamin) to Endophilin – depending on the time of the day. The
deletion of the period gene Period 2 in Per2BRDM1 mice resulted in the loss of
this oscillating interaction between VGlut1/Dynamin and Endophilin. This
effect emphasizes the individual trafficking process of VGlut1 in comparison
to other synaptic vesicle proteins, and its importance not only during endo-
but also exocytosis. In order to study the trafficking of VGlut2, a Rat
adrenal pheochromocytoma cell line (PC12) carrying VGlut2 was characterised.
In these cells, VGlut2 presumably translocates to the plasma membrane. Only
VGlut2- and not pcDNA3 transfected PC12 cells exhibit an immediate sodium
uptake across the plasma membrane in the presence of phosphate. VGlut2
functions in these cells as a sodium-phosphate-transporter and not as a
vesicular glutamate transporter, indicating a functional relevance subject to
the trafficking of the transporter. In summary, it was shown that: 1) whereas
VGlut1 binds to Endophilin, VGlut2 directly interacts with the adaptor complex
AP2. 2) The interaction of VGlut1 and Endophilin is regulated in a manner that
depends on the time of the day. 3) In transfected PC12 cells, VGlut2 functions
more as a sodium-phosphate transporter within the plasma membrane than as a
vesicular glutamate transporter.
en
dc.format.extent
X, 149 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
circadian rhythm
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Differenzielle Sortierung von VGlut1 und 2 und mögliche funktionelle Aspekte
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Volker Haucke, Institut für Chemie und Biochemie, FU Berlin
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Gudrun Ahnert-Hilger, Institut für Integrative Neuroanatomie ,
Charité – Universitätsmedizin Berlin
dc.date.accepted
2011-01-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000020722-0
dc.title.translated
Differential sorting of VGlut1 and 2 and possible functional aspects
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000020722
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000008854
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access