Die Untersuchung der pflanzlichen Organellentranskription am Beispiel der kernkodierten RNA-Polymerasen in Arabidopsis thaliana

Abstract

In Arabidopsis thaliana konnten drei kernkodierte RNA-Polymerasen (RpoT;1, RpoT;2 und RpoT;3) vom Phagentyp kloniert werden, die eine konservierte Genstruktur zeigen und deren Aminosäuresequenzen bis zu 55% homolog sind. Mit Hilfe von in organello-Import-Versuchen und dem Einsatz von GFP- Fusionsproteinen konnte die Zuordnung der drei Enzyme zu unterschiedlichen Organellen bestimmt werden. RNA-Polymerase 1 (RpoT;1) scheint ausschließlich in Mitochondrien benötigt zu werden, während der Wirkort von RNA-Polymerase 3 (RpoT;3) in Chloroplasten liegt. Im Gegensatz dazu stellte sich heraus, dass RNA-Polymerase 2 (RpoT;2), sowohl in Chloroplasten als auch in Mitochondrien importiert wird. Mit Hilfe der Antisense-Technik konnte für jede einzelne RNA- Polymerase eine Reduktion der Expression erzielt werden. Dabei zeigten die transformierten Pflanzen z. T. schwere phänotypische Effekte, diese reichten von Wurzel- und Sprossreduktion, Blatt- und Sprossdeformation bis hin zu Bleichung der Blätter und Anthocyanverfärbungen. Die genomischen 5'-Teile der RNA-Polymerasen zeigten bei den Antisense-Versuchen einen stärkeren Effekt als die 3'-Enden. Der Einsatz von cDNA-Konstrukten erzeugte hingegen eine Überexpression aller drei RNA-Polymerasen. Der Vergleich mit knock-out-Linien für die einzelnen RNA-Polymerasen zeigte, dass RNA-Polymerase 1 offensichtlich nicht durch die anderen beiden RNA-Polymerasen ersetzt werden kann, und der Mangel an RpoT;1 bereits früh zu einem embryoletalen Effekt führt. Für knock- out-Linien der RNA-Polymerase 3 zeigte sich, dass zumindest teilweise Ersatz durch RNA-Polymerase 2 (RpoT;2) möglich ist. Die Untersuchung von Antisense- Pflanzen für RNA-Polymerase 2 führte wiederum zu der Aussage, dass eine Reduktion dieser RNA-Polymerase eine Beeinflussung des RNA-Editings spezifischer Editingstellen (rpoB) zur Folge hat. Anhand dieser Beobachtungen liegt die Vermutung nahe, dass jede RNA-Polymerase über eigene spezielle Aufgaben zu definierten Entwicklungszeiten der Pflanze verfügt, und der Ersatz durch die jeweils anderen beiden RNA-Polymerasen nur in einem sehr beschränkten Rahmen möglich ist.

In Arabidopsis thaliana three nucleus-encoded phagetype RNA polymerases (RpoT;1, RpoT;2 and RpoT;3) were cloned. They show a conserved gene structure and have up to 55% aminoacid homology. By means of in organelle-import approaches and by using GFP-fusion-proteins, the localization of these three enzymes in different organelles was possible. Therefore RpoT;1 is only needed in mitochondria, RpoT;3 is targeted to plastids. In contrast to this, RNA polymerase 2 (RpoT;2) is imported in both plastids and mitochondria. Transcript reduction of each distinct RNA polymerase by means of antisense- approaches led to reduction of the expression. Transgenic antisense-plants displayed in part severe phenotype changes, e.g. root- and shoot-reduction, leave- and shoot-deformation including bleached and anthocyan-discoulored leaves. Thus genomic 5'-parts of the RNA polymerase sequences caused much stronger effects than 3'-ends. However, usage of cDNA constructs led to an overexpression of all three RNA polymerases. Comparison of knock-out-lines for each RNA polymerase revealed that replacing RpoT;1 by one of the other two RNA polymerases (RpoT;2 or RpoT;3) seems to be impossible. Loss of RpoT;1 causes lethal effects to the embryo in early plant developmental stages. Knock-out- lines for RpoT;3 showed an at least partial replacement by RNA polymerase 2 (RpoT;2). Examinations of RpoT;2-antisense plants, which showed trancript reduction for RNA polymerase 2, revealed an effect on RNA editing of specific sites (rpoB). All these facts seem to suggest that each of the three RNA polymerases is capable of exercising a specific function at certain stages of plant development. Therefore the possibility of a replacement by another RpoT is possible only to a limited degree.