dc.contributor.author
Jung, Marc
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:28:22Z
dc.date.available
2009-12-11T12:55:44.828Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5076
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9275
dc.description
ABBREVIATIONS IV ABSTRACT VII ABSTRACT (GERMAN) 1 1 INTRODUCTION 3 1.1 OCT4
regulated networks in pluripotent cells 3 1.1.1 Early Development – how a
single cell develops to a complex organism 3 1.1.2 The POU family
transcription factor OCT4 10 1.1.3 The diversity of binding site recognition
motifs of OCT4 13 1.1.4 Transcriptional network for pluripotency 16 1.2
Analysis of transcription factor binding sites 19 1.2.1 RNA interference 19
1.2.2 Chromatin Immunoprecipitation 21 1.2.3 Chromatin Immunoprecipitation
followed by microarray hybridization (ChIP-chip) 22 1.2.4 ChIP followed by
sequencing (ChIP-seq) 24 1.2.5 Identification of enriched sequences in ChIP-
chip experiments as a way to access potential binding sites 26 1.2.6 Motif
analysis and modules 28 1.3 Aim of this work 29 2 MATERIAL AND METHODS 30 2.1
Molecular biology 30 2.1.1 Polymerase Chain Reaction 30 2.1.2 Isolation of
plasmid DNA 31 2.1.3 Gel extraction and PCR purification 31 2.1.4 Cloning and
Sequencing of PCR-Products 32 2.1.5 Ligation 32 2.2 RNA analyses 32 2.2.1
Total RNA isolation using RNeasy® Mini Kit 32 2.2.2 RNA and cDNA
quantification 32 2.2.3 Agarose gel electrophoresis 33 2.2.4 Reverse
transcription 33 2.2.5 Real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR) 34
2.2.6 Illumina bead chip hybridisation 34 2.3 Protein analyses 35 2.3.1
Protein isolation 35 2.3.2 Protein quantification (Bradford) 35 2.3.3 SDS-PAGE
gel electrophoresis 35 2.3.4 Western blotting 36 2.3.5 Chromatin
Immunoprecipitation (ChIP) 37 2.3.6 Amplification of ChIP and Input DNA 38
2.3.7 Band shift assays (EMSA) 38 2.3.8 Pulldown assays using biotinylated DNA
38 2.3.9 Chromatin Immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) 39
2.4 Cell culture 39 2.4.1 Embryonal carcinoma cells, NCCIT cells 39 2.4.2
Transient Transfections 39 2.5 Data analysis 41 2.5.1 OCT4 ChIP array analysis
41 2.5.2 Microarray expression analysis 42 2.5.3 ChIP-seq in silico methods 43
3 RESULTS 46 3.1 ChIP-Chip data analysis 46 3.1.1 Specifity of the OCT4
antibody and the impact amplification bias has on site specific enrichment 46
3.1.2 Real time validation of known and putative OCT4 targets 48 3.1.3 ChIP-
chip raw data normalization and quality control 49 3.1.4 Impact of different
peak detection strategies on peal quality 54 3.1.5 Comparison of different
peak algorithms and rank based peak detection 57 3.1.6 Functional analysis and
comparison with literature 59 3.1.7 Six distinct OCT4 binding modules 64 3.1.8
Validation of selected conserved OCT4 binding sites 71 3.1.9 Validation of an
octamer site in the 5 prime proximal promoter of GADD45G 76 3.2 Induction of
GADD45G expression in NCCIT cells by Genistein 78 3.3 Transient overexpression
of GADD45G in NCCIT cells 79 3.4 Differences in the transcriptional levels
between human embryonal stem cells and human embryonal cancer cells 82 3.4.1
Comparison with other published datasets 84 3.4.2 Functional annotation
analysis of differential expressed genes 84 3.5 ChIP-seq data analysis of OCT4
targets in NCCIT cells 86 3.5.1 Data quality control 86 3.5.2 Saturation
analysis 88 3.5.3 Genome wide distribution of sequencing reads 90 3.5.4 Genome
wide distribution of binding regions 91 3.5.5 Comparative analysis of gene
associated binding regions 92 3.5.6 Motif mapping to binding regions 94 3.5.7
Functional regulation of OCT4 target genes 99 3.5.8 Functional enrichment
analysis 99 3.5.9 Summary 102 4 DISCUSSION 105 4.1 General considerations
regarding the ChIP technique 105 4.2 ChIP-chip results compared to literature
105 4.3 Data integration in the form of an Embryonic Stem Cell database 107
4.4 Different modules of OCT4 binding 109 4.5 USP44 is a potential cell cycle
regulator, controlled by OCT4 117 4.6 Genistein induces the upregulation of
GADD45G and has an effect on the expression of key pluripotency markers 117
4.7 GADD45G induces the upregulation of differentiation related genes 118 4.8
Differences between human EC and human ES cells 120 4.9 ChIP-seq discovered
OCT4 binding sites 121 5 CONCLUSION 123 REFERENCES A PUBLICATIONS L APPENDIX M
5.1.1 Solutions, Buffers and Media M 5.1.2 Buffers for SDS-PAGE gel
electrophoresis N 5.1.3 Buffers for western blotting O 5.1.4 Cells, Vectors
and antibodies P 5.1.5 Equipment and Reagents P 5.1.6 Supplemental material T
dc.description.abstract
Understanding the network of transcription factors, controlling pluripotency
in human embryonic stem cells (ESCs) and human embryonal cancer cells (ECs),
is essential for possible future therapies in medicine. Connecting the
expression levels after ablation of OCT4 with potential binding sites allows a
higher predictability of motif specific driven expression modules important
for self-renewal and differentiation. In this study several peak analysis
programs have been used to access a refined list of OCT4 targets in human EC
cells and this data was connected to ES cell specific OCT4 binding and
expression. A highly enriched POU-motif could be verified, discovered by a de
novo approach, thus enabling connections to the distribution of OCT4 connected
motifs like for the dimerisation factor SOX2. Selected targets have been
validated, containing an OCT4-SOX2 binding site in their proximal promoter,
and targets not connected to the classical HMG motif. Of those USP44 was
further examined, containing a highly conserved POU-motif and GADD45G, having
an impact on cell cycle regulation. The overexpression of GADD45G in EC cells
resulted in an enrichment for upregulated genes, connected to differentiation
pathways. Additionally preferred distances for the HMG and the POU motif could
be observed, giving cause for additional binding modes than the classical HMG-
POU consensus sequence. New OCT4 connected targets were discovered, and their
importance in ESC differentiation and pluripotency was highlighted. Through a
highly connected database, everyone can test now simple hypotheses based on
their target genes. The use of NCCIT cells as a model to test pluripotency
associated pathways in terms of potential functional binding sites has been
demonstrated. Furthermore array based comparisons of gene expression levels
between ES and EC cells have been conducted and new links have been
established for further functional characterisation of these cells. Finally a
ChIP-seq study revealed an unbiased genome wide view on putative OCT4 bound
regions and suggested a genome wide binding pattern for OCT4 which is not
centered for five prime proximal promoters.
de
dc.description.abstract
Für die Entwicklung möglicher, zukünftiger Therapien in der Medizin ist das
Verständnis jener Transkriptionsfaktoren, die die Pluripotenz kontrollieren
und die Differenzierung blockieren, von entscheidender Bedeutung. Nach einer
RNAi vermittelten Herunterregulierung von OCT4 wurde eine höhere
Vorhersagbarkeit von Motiv spezifischen Expressionsmodulen, die wichtig für
den Selbsterhalt und die Differenzierung der Zellen sind durch die Verknüpfung
von differentiell regulierten Genen mit potentiellen Bindungsstellen
ermöglicht. In dieser Arbeit wurden mehrere Programme für die Berechnung von
Bindungsstellen verwendet und kombiniert, um eine Algorithmen unabhängigere
Liste von potentiellen OCT4-Bindungsstellen in humanen embryonalen
Karzinomzellen zu erhalten. Die daraus resultierenden Daten wurden mit
spezifischen OCT4-Bindungsstellen und Expressionsmustern in embryonalen
Stammzellen verknüpft. Durch den Einsatz von De Novo Motiverkennungsprogrammen
konnte ein hoch angereichertes POU-Motiv verifiziert werden. Dadurch wurde
wiederum die Analyse der Verteilungsmuster von OCT4 korrelierten Motiven
ermöglicht, wie das HMG Motiv von SOX2, einem Heterodimerisierungspartners von
OCT4. Es wurden Kandidaten validiert, die ein OCT4-SOX2 Bindungsmotiv im
proximalen Promoterbereich enthielten, als auch solche, die nicht mit dem
klassischen HMG Motiv verknüpft waren. Von diesen wurde USP44 weitergehend
untersucht. Dieses Gen enthält eine hoch konservierte OCT4 Bindungsstelle. Des
Weiteren wurde das Gen GADD45G untersucht, das einen Einfluss auf die
Regulierung des Zellzyklus ausübt. Die Überexprimierung von GADD45G in EC
Zellen führte zu einer Anreicherung von hochregulierten Genen, die mit
Signalwegen der Differenzierung verknüpft sind. Zudem wurde ein Hinweis auf
bevorzugte Entfernungsbeziehungen zwischen dem POU und dem HMG Motiv gefunden,
die Grund zur Annahme geben, dass es neben dem klassischen HMG-POU Motiv
zusätzliche Bindungsvarianten von OCT4 gibt. Auf der Grundlage
Expressionsarray basierter Vergleiche zwischen zwei humanen Stammzellen- und
zwei humanen embryonalen Karzinomzelllinien wurden neue Verknüpfungen zu
annotierten funktionalen Signalwegen etabliert, um eine weitere
Charakterisierung dieser Zellen zu ermöglichen. Mit Hilfe der ChIP-seq Technik
wurde die genomweite Bindungsverteilung von OCT4 in humanen EC Zellen
analysiert um einen weniger verzehrten Blick zu ermöglichen. Diese weist
darauf hin, dass OCT4-Bindungsstellen nicht abhängig von der Entfernung zum
Transkriptionsstartpunkt sind. Es konnten neue Kandidatengene identifiziert
werden, die mit OCT4 verknüpft sind, und ihre Bedeutung für
Differenzierungsprozesse und Pluripotenz hervorgehoben. Durch die Einrichtung
einer hochvernetzten Datenbank, die alle relevanten OCT4 verwandten Daten
verknüpft, ist es nun möglich, einfache Hypothesen basierend auf spezifischen
Genlisten zu testen. Der Einsatz der EC Zelllinie NCCIT als Modellsystem für
die Untersuchung Pluripotenz-assoziierter Signalwege im Hinblick auf
potentielle funktionelle Bindungsstellen wurde erfolgreich demonstriert.
de
dc.format.extent
VII, 124, Z S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
transcription networks
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
OCT4 regulated transcription networks in human embryonic stem cells and human
embryonal carcinoma cells
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Hans Lehrach
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Thomas Schmülling
dc.date.accepted
2009-12-09
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000014759-5
dc.title.translated
OCT4 regulierte Transkriptionsnetzwerke in embryonalen Stammzellen und
embryonalen Karzinomzellen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000014759
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006749
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open access