Genetic diversity and population structure of the relict forest trees Zelkova carpinifolia (Ulmaceae) and Pterocarya fraxinifolia (Juglandaceae) in the South Caucasus

Abstract

Summary The dissertation presents an analysis of the genetic diversity and population structure of two mesophytic trees Zelkova carpinifolia (Ulmaceae) and Pterocarya fraxinifolia (Juglandaceae) in the South Caucasus. The Caucasus represents one of the global biodiversity hotspots. In part, its enormous biological diversity is constituted by a type of mesophytic forests which once covered larger areas in Eurasia. The current range of these forests is considerably reduced due to the major climate and tectonic changes from the Miocene up to climate oscillations in the Quaternary. Therefore, these forests and many of their species (being paleoendemics) have a relict status. There are two major climate refugia in the southern Caucasus region: the Colchis at the eastern coast of the Black Sea and the Hyrcan at the southern coast of the Caspian Sea. The Caucasian elm, Zelkova carpinifolia, and the Caucasian wingnut, Pterocarya fraxinifolia, are very characteristic trees of the Caucasian relict forests, for both of which the fossil record indicates a much wider distribution in the past. The current distribution area covers the Colchis and the Hyrcan, and some populations are found in southeastern Anatolia and the Zagros Mountains. P. fraxinifolia also occurs at the foothills of the Greater Caucasus and adjacent valley, whereas Z. carpinifolia grows in the Lesser Caucasus in Garabagh. Despite their similar distribution area, their ecological preferences differ. Zelkova carpinifolia grows on both moist and dry stony soils, whereas Pterocarya fraxinifolia requires moist soils and humid air. In the present work, a representative sampling of natural populations of Z. carpinifolia and P. fraxinifolia across their distribution area was carried out. Thirteen nuclear microsatellite markers were developed for Z. carpinifolia using next-generation sequencing (454 pyrosequencing). The genetic diversity and structure in both tree species was evaluated using nuclear and chloroplast loci. A specific objective was to test in how far Colchic and Hyrcanian populations of the trees are genetically separated. A further objective was to locate potential climate refugia and areas of high genetic diversity that deserve attention for conservation. Extensive sampling of populations of Z. carpinifolia and P. fraxinifolia across their main distribution ranges in the South Caucasus and northern Iran was carried out with fieldwork between 2010 and 2013. Thirty populations of Z. carpinifolia and of P. fraxinifolia were included for microsatellite analysis, respectively, while an incremented number of 40 populations were studied for chloroplast haplotypes in P. fraxinifolia. In Z. carpinifolia and P. fraxinifolia, the number of clonal individuals, detected as individuals with identical multilocus genotypes, varied substantially among sampling localities. In general, a low total number of alleles (2.35-3.63), a medium heterozygosity (0.425-0.604) and a low number of private alleles (0.01-0.14) were detected in Z. carpinifolia. Although relatively low numbers of alleles (2.8-4.9) and medium levels of heterozygosity (0.482-0.711) were also revealed in P. fraxinifolia, they were significantly higher than in Z. carpinifolia, especially in Hyrcan. The high number of private alleles (0.01-0.28) was also detected for populations of P. fraxinifolia from Hyrcan. The analysis of molecular variance (AMOVA) of nuclear microsatellite loci indicated low differentiation among Z. carpinifolia populations. No significant differentiation among the Colchic and Hyrcanian populations of Z. carpinifolia was found. Bayesian analysis, which is based on the assignment of individuals to different clusters using individual membership coefficients inferred from allele frequencies, clustered the populations in two groups (Colchic and Hyrcanian) but with a wide gradient. The lack of a strong genetic structure and of patterns of isolation-by-distance suggests that gene flow through pollen is extensive in Z. carpinifolia. Such extensive gene flow can, therefore, reduce inbreeding and genetic drift. The natural populations of Z. carpinifolia are, however, highly geographically structured at chloroplast DNA loci, indicating limited seed dispersal in the species in contrast to the extensive pollen dispersal. Although P. fraxinifolia is wind-pollinated, significant differentiation between Colchis and Hyrcan were revealed at the nuclear microsatellite loci. The two regions also differ at chloroplast DNA haplotype diversity. Eleven chloroplast haplotypes of P. fraxinifolia were found in Hyrcan, whereas only two were found in Colchis and the Greater Caucasus. In P. fraxinifolia, population structure is significant at both nuclear and chloroplast DNA loci, indicating more limited gene flow by both pollen and seeds. The higher genetic diversity in the Hyrcan, in addition to the high number of private alleles and chloroplast haplotypes in this region, possibly indicates the existence of multiple past climate refugia in the region for P. fraxinifolia. This potentially also applies to Z. carpinifolia, although our sampling in the Alborz Mountains (N-Iran) is more sparse in this species. The existence of past refugia for P. fraxinifolia in Colchis cannot be ruled out based on the results of the present study. The results of this doctoral thesis present a first comprehensive study of the genetic diversity and structure of natural populations of two relict tree species in the Caucasus. Z. carpinifolia and P. fraxinifolia are both wind-pollinated trees, but the patterns of gene flow inferred using nuclear microsatellite markers are different in two species. The low production of pollen in Z. carpinifolia does not limit the high gene flow among existing populations, whereas abundantly produced pollen in P. fraxinifolia is also widely dispersed among populations, but restricted in dispersal among geographic regions. The ecological preferences of the species might explain these patterns of gene flow by pollen, so that pollen is dispersed over the large distances in the dry air, whereas in the humid air pollen mainly disperses locally. The phylogeographical patterns revealed at chloroplast loci suggested past diversification of Z. carpinifolia populations (chloroplast data were provided by collaborators) in both potential refugia and diversification of P. fraxinifolia populations in Hyrcan. So, this study also represents one of the first attempts to localizing the past climate refugia for mesophytic trees and shrubs in the Caucasus using genetic data. To confirm the existence of past climate refugia in Colchis and Hyrcan, comparative analyses of the population genetics and phylogeography of other tree and shrub species in the region with different patterns of dispersal and reproductive systems should be performed. In future studies, more extensive sampling should be carried out, especially in Turkey and Iran, to obtain a complete picture of the genetic structure of both species throughout their distribution range. The information obtained is useful in the planning of future conservation management strategies, and for ex situ and in situ protection of relict Caucasian tree species. The following implications for conservation should be considered in the future: (i) forest fragmentation which may cause the inbreeding and genetic drift in populations has yet no effect on the genetic diversity of the natural populations due to the high gene flow among and within populations; (ii) some sites with higher genetic diversity at nuclear and/or chloroplast loci (high number of alleles and haplotypes private to populations) in both Colchis and Hyrcan should be protected; in particular the populations from Hyrcan deserve particular attention for conservation. (iii) plant material used in the reforestation practices should consider the provenances, so that the seeds should be produced from the local populations in order to maintain the unique genetic variation of each site.

Zusammenfassung In der vorgelegten Dissertation wird die genetische Diversität und Populationsstruktur der mesophytischen Reliktbäume Zelkova carpinifolia (Ulmaceae) und Pterocarya fraxinifolia (Juglandaceae) im Südkaukasus untersucht. Der Kaukasus gehört zu den globalen Biodiversitäts-Hotspots. Diese enorme biologische Vielfalt wird zum Teil durch einen Typ mesophytischer Wälder konstituiert, der einst größere Gebiete in Eurasien bedeckte. Bedingt durch die klimatischen und tektonischen Veränderungen seit dem Miozän, bis hin zu den Klimaoszillationen im Quartär, sind diese Wälder heute auf kleine Areale reduziert. Diese Wälder und ein Großteil ihrer Arten (sie sind Paläoendemiten) haben daher Reliktstatus. Es gibt zwei große klimatische Refugialräume in der südlichen Kaukasus-Region: Die Kolchis an der Ostküste des Schwarzen Meeres und der Hyrkan an der Südküste des Kaspischen Meeres. Die kaukasische Zelkove (Zelkova carpinifolia) und die Kaukasische Flügelnuss (Pterocarya fraxinifolia) sind charakteristische Elemente der kaukasischen Reliktwälder und für beide Arten zeigt der Fossilbeleg eine einst deutlich weitere Verbreitung als heute. Das aktuelle Areal umfasst die Kolchis und den Hyrkan, und einige Populationen komen in Südostanatolien und dem Zagros Gebirge vor. Pterocarya fraxinifolia gedeiht außerdem am Fuß des Großen Kaukasus und benachbarten Tälern, und Z. carpinifolia weist Populationen im Kleinen Kaukasus, in Garabagh, auf. Trotz ihrer ähnlichen Verbreitungsgebiete unterscheiden sich die ökologischen Präferenzen der beiden Arten. Zelkova carpinifolia wächst sowohl auf feuchten als auch trockenen steinigen Böden, wohingegen Pterocarya fraxinifolia feuchte Böden und feuchte Luft benötigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die natürlichen Populationen von Z. carpinifolia und P. fraxinifolia repräsentativ in ihrem Gesamtareal beprobt. Für Zelkova wurden mit Hilfe eines Next-Generation-Sequencing Ansatzes (454 Pyrosequenzierung) selbst Kern-Mikrosatelliten-Marker entwickelt. Dies ergab 13 polymorphe Kern-Mikrosatelliten-Marker für Z. carpinifolia. Die genetische Diversität und Struktur in beiden Baumarten wurde dann durch Verwendung von Kern- und Chloroplasten-Loci analysiert. Eine zentrale Fragestellung war dabei zu verstehen, in wie weit die kolchischen und die hyrkanischen Populationen voneinander genetisch isoliert sind. Ein weiteres Ziel war die Örtlichkeiten möglicher klimatischer Refugien und Gebiete mit hoher genetischer Diversität festzustellen, die besondere Aufmerksamkeit für Naturschutz-Maßnahmen erfordern. In den Jahren 2010 bis 2013 wurden Feldarbeiten durchgeführt, um Proben von Z. carpinifolia und P. fraxinifolia über ihr Hauptverbreitungsgebiet im Südkaukasus und im nördlichen Iran hinweg zu sammeln. Dreißig Populationen von Z. carpinifolia und 40 Populationen von P. fraxinifolia wurden dafür beprobt, wobei lediglilch 30 Populationen von P. fraxinifolia in die Kern-Mikrosatelliten-Analysen einbezogen wurden. Bei Z. carpinifolia und P. fraxinifolia variiert die Anzahl der klonalen Individuen (identifiziert als Individuen mit identischen Multilocus-Genotypen) erheblich zwischen den einzelnen Fundorten. Im Allgemeinen wurde eine geringe Gesamtanzahl von Allelen (2.35-3.63), eine mittlere Heterozygotie (0.425-0.604) und eine geringe Anzahl an Privaten Allelen (0.01-0.14) in Z. carpinifolia nachgewiesen. Obwohl auch eine relativ geringe Anzahl an Allelen (2.8-4.9) und ein mittleres Level an Heterozygotie (0.482-0.711) bei P. fraxinifolia gefunden wurde, war es signifikant höher als bei Z. carpinifolia, insbesondere im Hyrcan. Eine große Zahl privater Allele (0.01-0.28) wurde für die hyrkanischen Populationen von P. fraxinifolia ermittelt. Die Analyse der molekularen Varianz (AMOVA) der Kern-Mikrosatelliten zeigte eine nur geringe Differenzierung zwischen den Populationen von Z. carpinifolia. Es wurde keine signifikante Differenzierung zwischen den Populationen der Kolchis und des Hyrkan gefunden. Allerdings zeigte die Bayesianische Analyse, die auf der Zuordnung von Individuen zu unterschiedlichen Clustern basierend auf individuellen Zugehörigkeits-Koeffizienten, berechnet ausgehend von den realen Allelfrequenzen, beruht, zwei Cluster von Populationen (Kolchis und Hyrkanien). Beide Cluster sind allerdings durch einen weiten Gradienten miteinander verbunden. Das Fehlen einer starken genetischen Struktur, sowie das Fehlen von Mustern der räumlichen Isolierung, weisen darauf hin, dass der Genfluss bei Z. carpinifolia durch Pollen offenbar sehr umfangreich ist. Es liegt daher nahe anzunehmen, dass Inzucht und Genetische Drift bei dieser Art verringert werden. Im Gegensatz dazu sind die natürlichen Populationen von Z. carpinifolia in den Chloroplasten-DNA-Loci hochgradig geographisch strukturiert, was auf begrenzte Samenausbreitung in der Art, im Gegensatz zur umfangreichen Pollenausbreitung, hindeutet. Obwohl auch Pterocarya fraxinifolia windbestäubt ist, zeigen die Daten der Kern-Mikrosatelliten deutliche Unterschiede zwischen den Populationen in der Kolchis und dem Hyrkan. Die beiden Regionen unterscheiden sich auch sehr stark in der Diversität der Chloroplasten-DNA-Haplotypen. Während 11 Haplotypen wurden im Hyrkan gefunden wurden, sind es nur zwei in der Kolchis und im Großen Kaukasus. Sowohl Kern- als auch Chloroplasten-DNA-Loci weisen bei P. fraxinifolia eine signifikante Populationsstruktur auf, was auf limitierten Genfluss durch Pollen und Samen rückschließen lässt. Die höhere genetische Diversität im Hyrkan, zusätzlich zu der hohen Anzahl an privaten Allelen und Chloroplasten-Haplotypen in dieser Region, deutet möglicherweise auf die Existenz von mehreren Refugien für Z. carpinifolia und P. fraxinifolia gerade in den Gebirgen südlich des Kaspischen Meeres hin. Daher verdienen die Populationen des Hyrkan besondere Beachtung für den Naturschutz. Allerdings kann die Existenz von Refugien von P. fraxinifolia auch in der Colchis, basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, nicht ganz ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit stellen die erste umfassende Studie der genetischen Diversität und Struktur der natürlichen Populationen zweier Reliktbaumarten im Kaukasus dar. Dennoch sollten vergleichende Analysen der Populationsgenetik und der Phylogeographie von anderen Bäumen und Sträuchern der Region durchgeführt werden, um die Existenz vergangener Klima-Refugien in der Kolchis und im Hyrkan zu bestätigen. In weiterführenden Studien sollte außerdem ein umfangreicheres Sampling vor allem in der Türkei und im Iran durchgeführt werden, um ein noch besseres Bild der genetischen Struktur beider Arten im gesamten Verbreitungsgebiet zu erhalten. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind für die Planung von Naturschutz-Strategien und für den ex situ und in situ Schutz von reliktischen kaukasischen Baumarten nützlich. Die folgenden Empfehlungen für den Naturschutz lassen sich in diesem Zusammenhang ableiten: (i) Fragmentierung der mesophytischen Wälder, die grundsätzlich Inzucht und genetische Drift in den Populationen verursachen kann, hat wahrscheinlich noch keinen starken Effekt auf die genetische Diversität der natürlichen Populationen aufgrund eines hohen Pollen-bedingten Genflusses; (ii) einige Gebiete mit höherer genetischer Diversität sowohl im Kern- als auch Plastidengenom (große Zahl von privaten Allelen und Haplotypen in einzelnen Populationen) sowohl in der Kolchis als auch im Hyrkan sollten geschützt werden; die Populationen des Hyrkan sollten dabei besonders hohe Aufmerksamkeit bekommen; (iii) bei der Produktion von Pflanzenmaterial, das für Wiederaufforstungsmaßnahmen verwendet wird, sollten Provenienzen berücksichtigt werden, denn nur durch die Verwendung von Saatgut aus benachbarten, lokalen Populationen kann die einzigartige genetische Variabilität der unterschiedlichen Waldgebiete erhalten werden.