Characterization of Protein Kinase C Alpha Deficiency in a Mouse Model

Abstract

The protein kinase C (PKC) familiy was first described in 1977 by Nishizuka and colleagues, the pioneers in PKC research, and more than 30 years ago its role in human diseases was recognized. From that time onward, researchers worldwide endeavored to unravel regulatory functions of PKC isozymes in numerous major disorders. PKC-mediated phosphorylation of serine/threonine residues controls the activation of multiple downstream proteins. This central role in signal transduction as well as ubiquitous expression of most of the 11 PKC members makes it challenging to define the complexity of isozyme specific PKC functions. Dependent on their structure and consequent way of activation, the PKC family is classified into conventional (PKCa, PKCßI, PKCßII, PKC?), novel (PKCd, PKCe, PKC?, PKC?, PKCµ) and atypical (PKC?, PKC?/PKC?) PKC isozymes. The conventional PKCa is the most studied and best characterized isozyme, especially due to its crucial role in cancerogenesis. PKCa-evoked cellular proliferation, differentiation and apoptosis have been also proven and demonstrated in the pathogenesis of cardiovascular disorders. However, the exact role of PKCa in various pathologic conditions is still incompletely understood. The human lung disease pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by progressive changes in the morphology and function of pulmonary arteries. Several PKC isozymes including PKCa are known to modulate vascular smooth muscle function. Hence, the aim of the present work was to investigate PKC isozyme specific properties in the pulmonary vasculature following stimulation with vasoactive mediators that are important in the pathogenesis of PAH. For this purpose, effects of acute hypoxia, endothelin-1 (ET-1), serotonin and the thromboxane A2 (TXA2) analog U46619 were studies in isolated perfused and ventilated mouse lungs of PKCa deficient (PKCa-/-) and corresponding wildtype (Dempsey et al.) mice. Broad spectrum PKC inhibition in WT mice was achieved with the non-selective PKC inhibitor bisindolymaleimide I (BIM), while usage of Gö6976 evoked selective PKC inhibition of conventional PKC isozymes PKCa and PKCß. In this study, acute hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) was unaffected by loss of PKCa, whereas PKC inhibition with BIM significantly reduced HPV in WT mice. ET-1-induced vasopressor response, an important feature of PAH, was markedly attenuated by PKCa deficiency, non-selective and selective PKC inhibition suggesting a crucial role of PKCa in this scenario. In contrast, serotonin-evoked vasoconstriction was not affected by the absence of PKCa or by PKC inhibition with BIM. Notably, loss of PKCa caused pulmonary vascular hyperresponsiveness to the TXA2 analog U46619. mRNA expression analysis revealed increased thromboxane A2 receptor levels in microdissected intrapulmonary arteries from naïve PKCa-/- mice. Besides, mRNA expression of atypical PKC? was upregulated in intrapulmonary arteries from PKCa-/- mice. However, since PKC? inhibition with sodium aurothiomalate hydrate (ATM) had no effect on TXA2-induced vasopressor response, the observed hyperresponsivness to TXA2 analog U46619 might not involve PKC? but certainly TP receptor upregulation. Due to the random observation of esophageal dilation in PKCa-/- mice, further analyses were performed in 9-10-week-old and 14-month-old PKCa-/- and WT mice. Megaesophagus is a characteristic of human achalasia. The hallmark of achalasia is impaired smooth muscle cell relaxation of the lower esophageal sphincter (LES) due to neuronal degeneration of the esophageal myenteric plexus. Here, juvenile PKCa-/- mice showed a 60% prevalence of megaesophagus. With a prevalence of 10%, megaesophagi were present in aged PKCa-/- but also in WT mice independent of age. Histopathological investigations revealed an increased portion of the distal esophagus lined by smooth muscle cells in mice displaying meagaesophagus. However, achalasia-like inflammation, fibrosis or neuronal degeneration of the LES was not present. It was therefore hypothesized that loss of PKCa leads to delayed esophageal maturation due to failed replacement of embryonic smooth muscle cells by striated muscle cells. Since PKC isozyme expression profiles in LES of PKCa-/- mice showed decreased expression levels of four out of seven PKC isozymes, changes in the LES basal tone might have evoked smooth muscle cell hyperplasia at the distal esophagus leading to megaesophagus formation. Anyhow, PKCa deficiency appears to be associated with functional-muscular rather than neuronal achalasia-like pathological conditions. In conclusion, the results gained from this work substantially increase the understanding of PKC isozyme selective properties in the pulmonary vasculature and provide new data on PKCa involvement in smooth muscle cell function of lung and esophagus. Future work should verify the functional role of PKCa in PAH pathogenesis by PAH modeling and LES function by manometric studies.

Die Proteinkinase C (PKC)-Familie wurde erstmals 1977 von Nishizuka und Kollegen beschrieben und bereits vor mehr als 30 Jahren mit verschiedenen Krankheitsbildern assoziiert. Seitdem ist es Ziel von Wissenschaftlern weltweit die regulatorischen Funktionen der PKC-Isoenzyme in der Pathogenese von unterschiedlichen Erkrankungen zu erforschen und zu verstehen. Die PKC- vermittelte Phosphorylierung von Serine/Threonine-Resten moduliert die Aktivierung zahlreicher nachgeschalteter Proteine. Diese zentrale Rolle in der Signaltransduktion sowie die ubiquitäre Expression der meisten 11 PKC Mitglieder machen Untersuchungen Isoenzym-spezifischer PKC-Funktionen zur komplexen Aufgabe. Anhand ihrer Struktur und Art der Aktivierung werden die Mitglieder der PKC-Familie in herkömmliche (PKCa, PKCßI, PKCßII, PKC?), neuartige (PKCd, PKCe, PKC?, PKC?, PKCµ) und atypische Isoenzyme (PKC?, PKC?/PKC?) unterteilt. Die herkömmlichen PKCa ist das bisher am besten charakterisierte Isoenzym. PKCa-vermittelte zelluläre Proliferation, Differenzierung und Apoptose spielen eine Rolle in der Kanzerogenese, aber auch in der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen. Die exakte Rolle der PKCa in zahlreichen Erkrankungen ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die humane Lungenerkrankung pulmonalarterielle Hypertonie (PAH) zeichnet sich durch progressive morphologische und funktionelle Veränderungen der pulmonalen Arterien aus. Es ist bekannt, dass verschiedene PKC-Isoenzyme einschließlich der PKCa die Funktion vaskulärer glatter Muskelzellen regulieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung PKC-Isoenzym-spezifischer Funktionen im pulmonalen Gefäßsystem nach Einsatz vasokonstriktorischer Stimuli, die in der PAH-Pathogenese von Bedeutung sind. Dazu wurden die Effekte von akuter Hypoxie, Endothelin-1 (ET-1), Serotonin und dem Thromboxan A2 (TXA2) Analogon U46619 in isoliert perfundierte und ventilierte Lungen von PKCa-defizienten (PKCa-/-) und korrespondierenden Wildtyp-Mäusen (Dempsey et al.) analysiert. Zur PKC Inhibition wurden der nicht-selektive Breitspektrum- PKC-Inhibitor Bisindolymaleimide I (BIM) und der für die konventionellen PKC Isoenzyme PKCa und PKCß selektive Inhibitor Gö6976 in WT Mäusen eingesetzt. Die hypoxisch pulmonalen Vasokonstriktion (HPV) blieb bei PKCa Defizienz unverändert, wohingegen eine pharmakologische PKC-Inhibition mittels BIM zu einer signifikanten verminderten HPV in WT-Mäusen führte. Untersuchungen der ET-1-induzierten vaskulären Reagibilität zeigten eine deutlich reduzierte ET-1 vermittelte Vasokonstriktion durch PKCa-Defizienz ebenso wie durch nicht- selektive und selektive PKC-Inhibition. Im Gegensatz dazu blieb die Serotonin- induzierte Vasokonstriktion sowohl durch Fehlen von PKCa als auch durch PKC- Inhibition mittels BIM unverändert. Interessanterweise führte die Stimulation mit dem TXA2-Analogon U46619 zu einer pulmonalvaskulären Hyperreagibilität in PKCa-defizienten Mauslungen. Weiterführende mRNA-Analysen zeigten eine erhöhte Expression des Thromboxan A2-Rezeptors (Herve et al.) in mikrodissektierten intrapulmonalen Arterien naiver PKCa-/- Mäuse. Darüber hinaus wurde in PKCa-/- Mauslungen eine vermehrte mRNA Expression der atypischen PKC? gemessen. Eine selektive PKC? Inhibierung mittels Natriumaurothiomalat hatte jedoch keine Reduktion der U46619-vermittelten vaskulären Reagibilität zur Folge. Die beobachtete U46619-induzierte Hyperreagibilität in PKCa-/- Lungen scheint daher nicht PKC? vermittelt sondern primär bedingt durch die vermehrte TP Rezeptor Expression in intrapulmonalen Arterien zu sein. Der zufällige Befund der Ösophagusdilatation in PKCa-/- Mäusen wurde in 9-10 Wochen alten und 14 Monate alten PKCa-/- und WT Mäusen genauer untersucht. Der Megaösophagus ist ein Charakteristikum der humanen Achalasie. Hauptmerkmal der Achalasie ist die fehlerhafte Relaxation des unteren Ösophagussphinkters (UÖS), verursacht durch neuronale Degenerationen des Plexus Myentericus. Juvenile PKCa-/- Mäuse zeigten eine 60%ige Megaösophagus-Prävalenz. Mit einer Prävalenz von 10% wurden Megaösophagi in 14 Monate alten PKCa-/-, aber auch in WT-Mäusen altersunabhängig dokumentiert. Weiterführende histopathologische Untersuchungen der Megaösophagi zeigten einen vermehrten Anteil glatter Muskelzellen am distalen Ösophagusende. Achalasie-ähnliche Befunde wie Inflammation, Fibrose oder neuronale Degeneration des UÖS waren jedoch nicht vorhanden. Es ist anzunehmen, dass ein Verlust der PKCa zu einem fehlerhaften Umbau von embryonaler glatter zu quergestreifter Muskulatur und damit zu einer Verzögerung im Reifeprozess des Ösophagus führt. Da im UÖS PKCa-/- Mäuse eine verminderte Expression von vier von sieben PKC-Isoenzymen nachgewiesen wurde, könnte der Megaösophagus auch durch einen veränderten basalen Tonus des UÖS und einer daraus resultierenden Hyperplasie glatter Muskelzellen entstanden sein. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die PKCa-Defizienz eher mit funktionell-muskulären Störungen als Achalasie-ähnlichen Veränderungen assoziiert ist. Die Ergebnisse dieser Studie liefern neue Erkenntnisse bezüglich der PKCIsoenzym-selektiven Eigenschaften im pulmonalvaskulären Gefäßsystem sowie der Bedeutung der PKCa in glatten Muskelzellen in Lunge und Ösophagus. Zur Verifizierung der funktionalen Rolle der PKCa in der Pathogenese der PAH sowie zur genaueren Klärung der Bedeutung der PKCa für die UÖS Funktion sind weitere Studien notwendig.