dc.contributor.author
Penter, Livius
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:27:30Z
dc.date.available
2015-05-11T10:25:59.234Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5048
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9247
dc.description.abstract
Trotz intensiver Forschung an Radiochemotherapieschemata liegt die
5-Jahresüberlebensrate von Kindern mit Neuroblastom vom Hochrisikotyp noch
immer bei nur 50%. Ein neuer, vielversprechender Ansatz ist die Kombination
konventioneller Therapieprinzipien mit der spezifischen Inhibition zellulärer
Signalwege, die für Tumorigenese verantwortlich sind. Imatinib ist ein
Beispiel für dieses Konzept, das die 5-Jahresüberlebensrate von Patienten mit
Chronisch Myeloischer Leukämie von 30% auf 89% verbesserte. Das Ziel dieser
Arbeit war die Entwicklung eines synthetischen RNA-Interferenzscreens
basierend auf einer Neuroblastomzelllinie mit hoher Doxorubicinresistenz und
die Durchführung einer Pilotstudie zur Identifizierung potentieller
therapeutischer Ziele für die Behandlung des Neuroblastoms. Im Rahmen dieser
Arbeit wurde ein auf Durchflusszytometrie basierter Assay entwickelt, der mit
SH-EP als Reporterzelllinie die Identifizierung von shRNA-mir-
Expressionsvektoren erlaubt, die Neuroblastomzellproliferation verringern oder
Doxorubicin induzierten Zelltod erhöhen. SH-EP Zellen wurden mit pGIPZ
lentiviralen shRNA-mir Expressionsvektoren transduziert und anschließend drei
Tage lang mit Puromycin selektioniert. Nach weiteren drei Tagen Wachstum +/-
Doxorubicin wurden DNA-Gehalt und Zellviabilität mittels Durchflusszytometrie
und dem Zellvitalitätstest MTT bestimmt. shRNA-mir-Expressionsvektoren gegen
PLK1 und p53 wurden als Positivkontrollen etabliert, die Zellproliferation
inhibieren und Zelltod verstärken, bzw. Doxorubicinresistenz erhöhen. Die
Fähigkeit des Systems, therapeutische Ziele zu identifizieren, wurde mit 275
shRNA-mir-Expressionsvektoren gegen 69 Gene der Familie der F-box Proteine,
Schlüsselregulatoren zellulärer Signalwege, exemplarisch nachgewiesen. Dieser
Screen war in der Lage, drei Gene zu identifizieren, von denen bekannt ist,
dass sie eine Rolle in der Pathogenese des Neuroblastoms spielen: Fbxo5/Emi1,
Fbxw11/β-TrCP2 und Fbxo45. Der Assay wies eine hohe Trennschärfe auf, da der
Unterschied zwischen dem Signal der Positivkontrollen und dem Median
regelmäßig mehr als 2σ betrug. Aufgrund dieser erfolgreichen Pilotstudie
scheint es nun sinnvoll, weitere Genfamilien, deren Mitglieder bekanntermaßen
Schlüsselpositionen in wachstumsregulierenden Signalwegen besetzen, mit dem
entwickelten System zu untersuchen. Die Herausforderung besteht darin, den
Durchsatz des Systems dadurch zu erhöhen, Durchflusszytometrie mit einem
ähnlich sensitiven, aber weniger zeitaufwändigen Read-out zu ersetzen, wie zum
Beispiel automatisierter Mikroskopie oder einem Fluoreszenz basierten
Reportersystem. Damit wird es möglich sein, die Fragestellung des Screens
auszuweiten und die Suche nach neuen therapeutischen Zielen für Patienten mit
Neuroblastom vom Hochrisikotyp zu beschleunigen.
de
dc.description.abstract
Even after extensive research on radiochemotherapy, the 5-year survival rate
of children with high risk neuroblastoma still does not exceed 50%. A
promising, new approach is the combination of conventional therapies with
specific inhibition of cell signaling that promotes tumorigenesis. Imatinib
set an impressive example for this concept by increasing the 5-year survival
rate of chronic myeloic leukemia patients from 30% to 89%. In order to
identify genes that could be inhibited to improve the therapeutic outcome of
high risk neuroblastoma patients, we sought to establish an RNA-interference
based synthetic lethal screen, using a highly doxorubicin resistant
neuroblastoma cell line. We developed a flow cytometry-based assay, which
enables the identification of shRNAmir expression vectors that reduce tumor
cell proliferation or augment doxorubicin-induced cell death, employing SH-EP
as neuroblastoma reporter cell line. SH-EP cells transduced with pGIPZ
lentiviral shRNAmir expression vectors were selected with puromycin for three
days. After subsequent growth in fresh medium +/-doxorubicin for three days,
cell cycle distribution and cell viability were measured using flow cytometry
and MTT assay. shRNAmir expression vectors targeting PLK1 and p53 were
established as positive controls that markedly inhibit cell proliferation and
increase cell death, or elevate doxorubicin resistance, respectively. The
capacity of the system to identify potential therapeutic targets was assessed
by knocking down the family of F-box proteins, key regulators of cellular
signaling, using 275 shRNAmir expressions vectors targeting 69 genes. This
screen recapitulated three genes known to play a role in neuroblastoma:
Fbxo5/Emi1, Fbxw11/β-TrCP2 and Fbxo45. The employed positive controls, being
more than two standard deviations from the mean, indicated the desirably high
sensitivity of the assay. This successful pilot study now rationalizes a knock
down strategy of larger groups of genes related to tumorigenesis, such as
phosphatases and kinases. One major challenge will be to increase the
throughput of the system by replacing flow cytometry with an equally sensitive
but less time-consuming read-out, like automated microscopy or a fluorescence
based reporter assay. This will allow broadening the scope of the screen and
accelerate the quest for new drugable targets to increase the chance of
successfully treating high risk neuroblastoma patients.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
RNA-interference
dc.subject
targeted therapy
dc.subject
F-box proteins
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Entwicklung eines lentiviralen shRNA Screens zur Identifizierung potentieller
therapeutischer Ziele in SH-EP Neuroblastomazellen
dc.contributor.contact
livius.penter@web.de
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2015-05-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000096773-4
dc.title.translated
Identification of novel therapeutic targets for high risk neuroblastoma
patients: development of a lentiviral shRNA screen
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000096773
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000016777
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access